杆状病毒表达系统的信号肽及其应用技术方案

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及杆状病毒表达系统的信号肽及其应用。本发明专利技术利用HA的信号肽促进外源蛋白在昆虫细胞中的表达，并且能够顺利的将表达的蛋白引导到胞外。能够顺利的将表达的蛋白引导到胞外。

【技术实现步骤摘要】
杆状病毒表达系统的信号肽及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及杆状病毒表达系统的信号肽及其应用。

技术介绍

[0002]杆状病毒(又称多角体病毒或颗粒体病毒)有两类病毒体，芽殖病毒体(buded virion，BV)和多角体源性病毒体(polyhedron derived virion,PDV)。在病毒复制过程中，首先产生BV，BV核壳产生后通过芽生方式从细胞中释放出来，再感染其它细胞，复制后期产生PDV，PDV核壳产生后在细胞核内获得包膜，再被包被在蛋白质包含体中，直到细胞裂解后才被释放到周围环境中，再感染其它细胞。
[0003]杆状病毒是近年来被广泛用于高效表达外源蛋白的载体系统，体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞系统，它操作简便，周期短，收益大，表达产物稳定，但是表达基因的分子量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工作用。真核细胞系统包括COS细胞、CHO细胞、酵母细胞和昆虫细胞等表达系统。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
[0004]昆虫细胞培养及操作较简便，成本低，因此被广泛用于生产基因工程产品。但目前能在该系统中普遍使用较多的为Gp64杆状病毒，Gp64膜蛋白的生产效率并不是很高，而且在某些情况下此信号肽并不能较好的引导靶蛋白实现高效分泌，因此有必要探究一种新型高效分泌的引导信号肽做为规模化生产来使用。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供杆状病毒表达系统的信号肽及其应用。
[0006]本专利技术提供了SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽在制备杆状病毒表达系统外源蛋白的信号肽的应用。
[0007]本专利技术对多个信号肽进行验证，包括Melittin来源的信号肽、GP64来源的信号肽、HIV
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ENV来源的信号肽，HA来源的信号肽。
[0008]具体的，Melittin来源的信号肽的氨基酸序列为MKFLVNVALVFMVVYISYIYA；GP64来源的信号肽的氨基酸序列为MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA；HIV
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ENV来源的信号肽的氨基酸序列为MNIKFLVNVALVFMWYISYIYADPINMTGS；HA来源的信号肽的氨基酸序列为MKTIIALSYIFCLVF。
[0009]结果表明，HA来源的信号肽能够更高效的促进外源蛋白的表达。
[0010]本专利技术还提供了一种融合蛋白，其包括：依次包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽、linker、剔除信号肽的外源蛋白。
[0011]本专利技术中，所述linker的氨基酸序列为ASGR。
[0012]本专利技术中所述外源蛋白的信号肽被剔除，一些实施例中，所述外源蛋白为圆环病毒的Cap蛋白。本专利技术对不同长度的Cap蛋白的N端进行剔除，实验表明，剔除N端1～41aa氨
基酸的Cap蛋白后，融合蛋白的表达量最高。
[0013]为了方便蛋白的纯化，在融合蛋白的C端还连接有标签。本专利技术中，所述标签为10
×
His标签。
[0014]一些具体实施例中，本专利技术提供的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]本专利技术还提供了编码所述的融合蛋白的核酸。
[0016]本专利技术实施例中，信号肽或外源蛋白的编码核酸序列经过密码子优化。本专利技术根据昆虫细胞SF9对编码核酸的密码子进行优化。
[0017]其中编码SEQ ID NO:1所示多肽的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。具体的，其核酸序列为atgaagaccatcattgctttgagctacattttctgtctggtgttc。
[0018]编码SEQ ID NO:2所示融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0019]本专利技术还提供了一种质粒载体，其骨架载体为pFASTbac，包括本专利技术所述的核酸。本专利技术中，所述pFASTbac载体为杆状病毒穿梭载体。本专利技术所述核酸的插入位点为Not I和Xho I之间。
[0020]本专利技术中还提供了转化或转染所述质粒载体的宿主。
[0021]本专利技术中所述宿主细胞为sf9细胞或大肠杆菌细胞。
[0022]所述质粒载体在大肠杆菌中增殖、保存，在sf9昆虫细胞。
[0023]所述融合蛋白的制备方法，其培养宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。
[0024]本专利技术利用HA的信号肽促进外源蛋白在昆虫细胞中的表达，并且能够顺利的将表达的蛋白引导到胞外。实验表明，以HA信号肽与Cap蛋白融合，宿主细胞培养后密度为1.5
×
106个/ml，表达量为15～20mg/L。
附图说明
[0025]图1示构建模式；
[0026]图2示质粒图谱；
[0027]图3示不同信号肽引导Cap表达能力对比；
[0028]图4示HA引导圆环Cap的分泌表达；
[0029]图5示HA引导圆环Cap蛋白的wb结果；
[0030]图6示圆环Cap蛋白TEM电镜图片。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供了杆状病毒表达系统的信号肽及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0032]本专利技术首先使用特异性引物从流感病毒中扩增引导HA蛋白的外泌信号肽，同时引入酶切位点。然后使用特异性引物从圆环病毒基因组中扩增的到圆环病毒Cap基因，同时引入酶切位点，用于后续构建。使用实验室保存的pFASTbac质粒复苏、扩大后提取制备，使用紫外分管光度计检测浓度后满足后续酶切使用。
[0033]使用NotI和XhoI对提到的片段和载体酶切，胶回收鉴定。得到的片段使用T4连接酶酶连，构建pFASTbac
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HA
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Cap和pFASTbac
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Cap。将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，鉴定。
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80℃种取出DH10Bac E.coli感受态细胞冰上解冻。
[0034]将200ng的pFastBac1
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gene转移载体缓慢加入感受态细胞中，轻轻混匀后冰上放置20min，然后42℃热击90s；8、迅速冰上静止5min后向EP管里加入1ml无抗培养基37℃，200rpm震荡摇菌2h。取10μl菌液涂于含有50mg/ml卡那霉素，7mg/ml庆大霉素，10mg/ml四环素，100mg/mlx
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gal,40mg/mlIPTG的LB平板上，锡纸包裹完全后在37本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽在制备杆状病毒表达系统外源蛋白的信号肽的应用。2.融合蛋白，其特征在于，包括：依次包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽、linker、剔除信号肽的外源蛋白。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述外源蛋白为圆环病毒的Cap蛋白。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。5.核酸，其特征在于，编码权利要求2～4任一项所述的融合蛋白，其中编码SEQ ID NO:1所示多肽的核酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛旻，杨瑞华，贾宾，乔洋洋，单玲玲，
申请(专利权)人：河南兴华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：