副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用技术

本发明专利技术公开了副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用，属于兽用生物制品领域。本发明专利技术构建了并表达了能够同时预付副鸡嗜血杆菌A、B、C三个血清型的融合蛋白rApg

【技术实现步骤摘要】
副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用


[0001]本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用。

技术介绍

[0002]副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)，是巴氏杆菌科禽杆菌属(Avibacterium)的一种短小革兰阴性杆菌，为鸡传染性鼻炎(Infectiouscoryza，IC)的病原菌，引起鸡的急性或亚急性呼吸道感染，临床表现为鼻腔、眶下窦和气管上部发炎、流泪、流鼻液、呼吸困难。病鸡打喷嚏、摇头，颜面部单侧或双侧水肿。副鸡嗜血杆菌可造成蛋鸡产蛋量下降，肉鸡肉质下降，生长鸡群发育迟缓受阻和淘汰率增加，对养鸡业造成较大的经济损失，严重影响养鸡业的发展。
[0003]鸡传染性鼻炎发病率高，大龄鸡比小鸡易感，死亡率一般不超过20％。鸡传染性鼻炎广泛分布于世界各地，BEACH于1920年首先报道了该病，而1931年DEBLIEKC首次分离到Hpg。我国于1987年首次在北京分离到鸡传染性鼻炎病原，相继在河北、辽宁、山东等地有分离到Hpg的报道。在我国，Hpg发病率为20％～50％，死亡率5％～20％，在并发鸡毒支原体病或其他传染病时会表现出病程延长和死淘率升高。
[0004]副鸡嗜血杆菌具有多种血清型，按照玻片凝集试验可将该菌分为A、B、C这3个血清型。按照间接血凝抑制试验可以分为A、B、C 3个血清群9个血清型。目前市场上有二价疫苗、三价疫苗等多种防控鸡传染性鼻炎的疫苗产品，尤其是A、B、C全菌三价疫苗能够对所有血清型的鼻炎提供保护，因而市场容量较大。但由于副鸡禽杆菌属于苛生菌，培养成本较高，而且全菌灭活疫苗中含有大量的菌体蛋白、内毒素、其他毒性物质以及附加物等因素，易造成较为严重的副反应，在接种部位还会形成局灶性坏死斑。
[0005]另一方面，对于副鸡嗜血杆菌基因工程亚单位疫苗的研究，目前还是集中在使用大肠杆菌表达系统进行抗原表达的。众所周知，大肠杆菌表达系统表达的抗原，其内毒素的去除工艺较为繁琐，加大了产业化难度及疫苗使用的安全性。

技术实现思路

[0006][技术问题][0007]本专利技术要解决的技术问题是用于防治鸡传染性鼻炎的全菌疫苗存在成本高、副反应严重的问题，而制备基因工程亚单位疫苗时，使用大肠杆菌表达系统表达得到的抗原需要经过繁琐的纯化工艺、难以产业化且影响疫苗安全性。
[0008][技术方案][0009]本专利技术提供一种重组杆状病毒，接种昆虫细胞后，能够高效表达用于预防副鸡嗜血杆菌感染导致的鸡传染性鼻炎的3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC。
[0010]所述3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011]编码所述3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本专利技术提供一种重组转移载体，是将编码所述3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的基因与pFastBac I转移载体连接得到的pFastBac
‑
rApg
‑
ABC转移载体。
[0013]本专利技术提供所述重组杆状病毒的制备方法，是将编码所述3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的基因，连接至转移载体，将重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获重组杆状病毒。
[0014]本专利技术提供应用所述重组杆状病毒制备重组抗原的方法，是将编码所述3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的基因，连接至转移载体，将重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获、纯化重组抗原。
[0015]本专利技术提供副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所述抗原为灭活的重组抗原。所述灭活可以是BEI灭活、甲醛灭活、β
‑
丙内酯灭活。
[0016]所述疫苗中重组蛋白的含量在20～50μg/mL之间。
[0017]所述重组抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO：1(含组氨酸标签)。
[0018]所述疫苗佐剂为矿物油佐剂。
[0019][有益效果][0020]本专利技术将表达重组蛋白的重组杆状病毒rBac
‑
rApg
‑
ABC，接入到昆虫细胞中高效地表达rApg
‑
ABC蛋白，经过离心去除细胞碎片，加入灭活剂灭活后，得到重组抗原，将重组抗原与矿物油佐剂混合乳化制成疫苗。本专利技术制备疫苗的方法，能够有效避免内毒素的问题；同时，真核表达系统由于具有完善的蛋白后修饰功能，所表达的重组抗原的而免疫效果更为优越，在较低量的抗原添加情况下即可达到免疫保护效果。
[0021]本专利技术制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
附图说明
[0022]图1是SDS
‑
PAGE检测重组杆状病毒表达产物。M：预染蛋白质Marker；1：rApg
‑
ABC；2：对照。
[0023]图2是WesternBlot鉴定重组杆状病毒表达产物。M：预染蛋白质Marker；1：rApg
‑
ABC；2：对照。
具体实施方式
[0024]实施例1：重组杆状病毒rBac
‑
rApg
‑
ABC的构建
[0025]1、设计编码融合蛋白rApg
‑
ABC的基因片段，并提交南京金斯瑞根据昆虫细胞密码子偏好性进行序列优化，并将优化后的序列(SEQ ID NO:2)合成至pFastBac I转移载体上，得到pFastBac
‑
rApg
‑
ABC转移载体。
[0026]2、重组杆状病毒构建：
[0027]将转移载体pFastBac
‑
rApg
‑
ABC转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，挑选阳性克隆用M13引物作PCR鉴定。M13
‑
F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13
‑
R：CAGGAAACAGCTATGAC。PCR反应体系为(总体积25μL)：DNA模板0.5μL、M13
‑
F和M13
‑
R各0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。PCR反应条件为：95℃，5min；95℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约3000bp的特异性条带，与预期大小相符。将阳性重组杆粒命
名为rBacmid
‑
rApg
‑
ABC。
[0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组转移载体，其特征在于，是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的基因与pFastBac I转移载体连接得到的。2.根据权利要求1所述的一种重组转移载体，其特征在于，编码所述3个血清型融合蛋白rApg
‑
ABC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种重组杆状病毒，其特征在于，是将权利要求1或2所述重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获重组杆状病毒。4.应用权利要求3所述重组杆状病毒制备重组抗原的方法，其特征在于，是将权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘杰，李晓明，迟强伟，王绍君，丁国伟，荣雪路，李甜甜，魏荣荣，叶正琴，李琛，潘晨，陈林中日，陈森，
申请(专利权)人：扬州优邦生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：