本发明专利技术公开了一种基因缺失型杆状病毒载体。该载体缺失杆状病毒非必需基因Ac129、Ac130和Ac131，使外源蛋白表达水平显著提高。病毒的增殖速度有所降低，但最终滴度与对照没有显著差异。表达产量的提高能降低企业的生产成本，缺失大段基因能使载体容量增加。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域，特别是亚单位疫苗工业领域。
【技术实现步骤摘要】
一种Ac129-131缺失的杆状病毒载体
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种基因缺失的杆状病毒载体。
技术介绍
杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus,AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年SmithGE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β-干扰素基因以来（MolCellBiol.1983;3:2156-65.），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。但相较于工业上普遍使用的原核表达系统（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）和酵母表达系统，杆状病毒表达载体系统的产量还不尽人意。为此人们采取了多种策略提高该表达系统的产量，这些策略包括：1、改造启动子及周边元件。比如通过串联p6.9和p10启动子可以将GFP产量提高4.4倍（PLoSONE.2014;9(5):e96562.）；在polh启动子下游重复一次Burstsequence可以使GUS酶活提高1.5倍（BiotechnolBioeng.2010;107:909-16.）。2、构建抗凋亡载体或细胞系。用RNA干扰载体在昆虫细胞Sf9中表达Sf-caspase-1的dsRNA，可以成功沉默细胞中的Sf-caspase-1，使外源蛋白的产量显著提高（BiotechnolApplBiochem.2007;48:11-19.）。张潇月等将靶向Sf-caspase-1的双链小RNA编码序列直接克隆到杆状病毒基因组上，使表达的荧光素酶活性提高10倍（BMCBiotechnol.2018;18:24.）。3、敲除非必需基因。比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/V-Cath）有助于提高分泌蛋白的表达（JVirolMethods.2004;122:113-118.）；在此基础上再敲除三个连续的非必需基因p26、p10、p74，可以使EGFP的产量增加2.6倍（CellBiolToxicol.2010;26:57-68.）。敲除非必需基因提高外源基因产量的机制是多样的。敲除组织蛋白酶（V-Cath）基因可以降低蛋白质的降解；敲除p10可以释放感染晚期的细胞内转录资源。此外，敲除非必需基因也可以减小杆状病毒基因组的大小，有利于容纳更大的外源DNA片段。野生型杆状病毒最多能插入大约40kb的外源DNA片段，如果用一个重组病毒表达多个蛋白，或用杆状病毒载体装载另一个病毒载体（如腺病毒载体），40kb的空间经常捉襟见肘。如果能通过大段敲除基因，释放更多的空间，将极大扩展杆状病毒表达载体的应用范围。专利技术人通过检索文献，发现杆状病毒基因组中存在大量非必需基因，并且一些非必需基因彼此相邻成簇存在，这些基因簇包括Ac129至Ac131的三个连续非必需基因。Ac129编码一个含有198个氨基酸分子量大小为22.1kDa的蛋白质（P24核衣壳蛋白）。研究显示在AcMNPV中利用转座因子可以破坏该基因，说明该基因是非必需基因（JGenVirol.1989;70:1815–1828;JVirol.1990;64:1844–1850.）。在BmNPV中，该基因的同源基因Bm106的插入/缺失突变不会致死，但是会延长病毒杀死昆虫的时间（RIKENReview.1999;22:39–41.）。Ac130编码一个含有106个氨基酸分子量大小为12.1kDa的蛋白质（GP16），该基因可能与细胞质中的核壳囊膜有关，但与ODV或BV的产生无关（Virology.1993;192:386–390.）。BmNPV中的同源基因为非必需基因（VirusRes.2012;165:197–206.）。Ac131编码一个含有322个氨基酸分子量大小为36.4kDa的多角体囊膜蛋白（PEP），该基因的同源基因存在于所有的α，β和γ型杆状病毒基因组中（JVirol.2012;86:12069–79;SciRep.2017;7:46187.）。当该基因被敲除时，多角体缺乏完整的结构从而呈现出粗糙的表面结构（JGenVirol.1994;75:1115–1123.）。总的说来，Ac129、Ac130和Ac131都是杆状病毒的非必需基因或疑似非必需基因，至少在昆虫细胞系中复制时，这三个基因并不表现出重要的功能。同时缺失或失活这些基因对外源基因表达量的影响以及病毒的增殖还未曾被关注过。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因缺失型杆状病毒载体，旨在解决
技术介绍
提及的表达量低及外源DNA片段容量低的问题。本专利技术通过在杆状病毒载体上同时缺失或失活Ac129、Ac130和Ac131，获得了一个外源蛋白产量提高的杆状病毒载体。本专利技术是这样实现的，用同源重组或基因编辑等技术，从杆状病毒载体上敲除Ac129-131片段，即获得Ac129、Ac130和Ac131缺失的杆状病毒载体。或在合成杆状病毒载体时，不包含Ac129、Ac130和Ac131基因，即获得Ac129、Ac130和Ac131缺失的杆状病毒载体。或对Ac129、Ac130和Ac131基因的启动子区和/或编码区和/或3’非编码区进行碱基缺失、插入、替换，使基因丧失原有活性，即获得Ac129、Ac130和Ac131失活的杆状病毒载体。本专利技术另一目的在于在于提供一种重组杆状病毒，用所述Ac129、Ac130和Ac131缺失或失活杆状病毒载体与带有外源序列的DNA片段重组，即获得所述重组杆状病毒。本专利技术另一目的在于提供一种重组蛋白，用所述缺失型杆状病毒载体构建重组病毒，然后感染昆虫宿主细胞并表达为重组蛋白，即获得所述重组蛋白。经测定，用所述缺失型杆状病毒载体构建的重组杆状病毒，其增殖速度虽然有所降低，但最终滴度与野生型无显著差异。缺失型杆状病毒的外源重组蛋白表达量显著高于对照载体。本专利技术缺失Ac129、Ac130和Ac131基因后，使病毒基因组减少了约1.8kb，蛋白表达水平显著提高。说明本专利技术确实能提供一个具有优良生产性状和高产特性的杆状病毒载体。本专利技术另一目的在于提供了所述基因敲除型杆状病毒载体在生物制品工业上的应用。附图说明图1本专利技术提供的杆状病毒载体的基因敲除策略示意图；图2本专利技术提供的BacmidΔAc129-131杆状病毒载体的一次生长曲线；图3使用本专利技术提供的BacmidΔAc129-131杆状病毒载体表达的绿色荧光蛋白GFP，病毒感染后4天的细胞经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色的结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。1、Ac129-131基因的敲除。敲除策略详见附图1。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杆状病毒载体，其特征在于，杆状病毒载体中Ac129、Ac130和Ac131基因缺失或失活。/n
【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒载体，其特征在于，杆状病毒载体中Ac129、Ac130和Ac131基因缺失或失活。
2.一种重组杆状病毒，其特征在于，用权利要求1所述的杆状病毒载体与DNA片段重组，即获得所述重组杆状病毒。...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：陕西杆粒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。