用于修饰SCN9A或SCN10A基因的基因编辑系统及其使用方法技术方案

本文公开了用于体外或体内编辑电压门控钠通道基因，例如钠电压门控通道α亚基9(SCN9A)或钠电压门控通道α亚基10(SCN10A)的高效基因编辑系统。本文所公开的基因编辑系统包含RNA引导的DNA核酸内切酶和特异性向导RNA。本文还提供了基因编辑系统修饰靶基因，从而减轻疼痛的用途。而减轻疼痛的用途。而减轻疼痛的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于修饰SCN9A或SCN10A基因的基因编辑系统及其使用方法
[0001]相关申请
[0002]本申请依据35 U.S.C.
§
119(e)要求2019年4月12日提交的美国临时申请号62/833,523的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

技术介绍

[0003]基因编辑(包括基因组编辑)是一种类型的基因工程，其中在DNA序列中，例如在靶向细胞的基因组中插入、缺失/或取代一个或多个核苷酸/核酸。最近利用RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9)的基因编辑策略能够实现位点特异性DNA修饰；然而，已经发现并非所有RNA引导的核酸内切酶向导RNA对高效地进行编辑。因此，仍然迫切需要鉴定有效地修饰所关注的基因的有效RNA引导的核酸内切酶向导RNA对。

技术实现思路

[0004]本公开至少部分基于用于修饰电压门控钠通道基因，例如钠电压门控通道α亚基9(SCN9A)或钠电压门控通道α亚基10(SCN10A)的有效基因编辑系统的开发。在一些实施方案中，基因编辑系统依赖于对用于有效修饰电压门控钠通道基因而具有低脱靶发生率的有效RNA引导的核酸内切酶和向导RNA对(例如，本文所公开的那些)的鉴定。
[0005]因此，在一些方面，本公开涉及用于修饰电压门控钠通道基因，例如SCN9A或SCN10A的基因编辑系统。这种基因编辑系统可以包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码RNA引导的DNA核酸内切酶的第一核苷酸序列，或RNA引导的DNA核酸内切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导RNA(gRNA)的第二核苷酸序列。
[0006]在一些实施方案中，基因编辑系统可以修饰SCN9A基因并且包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码RNA引导的DNA核酸内切酶的第一核苷酸序列，或RNA引导的DNA核酸内切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:1
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20中任一者的核苷酸序列。如本文所用的多核苷酸部分可以是独立的核酸分子。或者，多核苷酸部分可以是核酸分子的一部分，这部分可以含有一个或多个另外的多核苷酸部分。
[0007]这种基因编辑系统的RNA引导的核酸内切酶可以是酿脓葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes)(SpCas9)，它可以与包含SEQ ID NO:1
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10中任一者的核苷酸序列的gRNA配对。或者或另外，这种基因编辑系统的RNA引导的核酸内切酶可以是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)，它可以与包含SEQ ID NO:11
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20中任一者的核苷酸序列的gRNA配对。
[0008]在一些实施方案中，基因编辑系统可以修饰SCN10A基因并且包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码RNA引导的DNA核酸内切酶的第一核苷酸序列，或RNA引导的DNA核酸内切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:21
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40中任一者的核苷酸序
列。这种基因编辑系统的RNA引导的核酸内切酶可以是SpCas9，它可以与包含SEQ ID NO:21
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30中任一者的核苷酸序列的gRNA配对。或者或另外，这种基因编辑系统的RNA引导的核酸内切酶可以是SaCas9，它可以与包含SEQ ID NO:31
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40中任一者的核苷酸序列的gRNA配对。
[0009]在一些实施方案中，(a)中编码RNA引导的DNA核酸内切酶的第一核苷酸序列还可以包含编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列，所述核苷酸序列与RNA引导的DNA核酸内切酶框内融合。在一些实施方案中，NLS是SV40 NLS。
[0010]在一些实施方案中，(b)中的第二核苷酸序列还可以包含支架序列。在一些实例中，支架序列可以由SaCas9识别。这种支架序列可以包含核苷酸序列GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUU(SEQ ID NO:41)。在其它实例中，支架序列可以由SpCas9识别。应了解，由于编码gRNA的第二核苷酸序列可以是DNA序列或RNA序列，因此这个序列中的任何尿嘧啶(U)都可以被胸腺嘧啶(T)置换。
[0011]在一些实施方案中，(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分是不同的多核苷酸，其中至少一者可以是载体。载体可以是病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分是不同的AAV载体。
[0012]在一些实施方案中，单个多核苷酸包含(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分。单个多核苷酸可以是载体，所述载体可以是病毒载体，例如AAV载体。在一些实施方案中，AAV是AAV1。
[0013]在本公开的范围内还有核酸和病毒颗粒或病毒颗粒组，它们集合地包含本文所公开的任何基因编辑系统。在一些实施方案中，病毒颗粒或病毒颗粒组是一种或多种AAV颗粒。
[0014]在其它方面，本公开涉及编辑电压门控钠通道基因，例如SCN9A或SCN10A的方法，所述方法包括使细胞与以下接触：(i)本文所公开的任何基因编辑系统；(ii)包含基因编辑系统的核酸；或(iii)病毒颗粒或病毒颗粒组，它们集合地包含基因编辑系统。
[0015]在一些实施方案中，接触步骤通过向有需要的受试者施用(a)的基因编辑系统、(b)的核酸或(c)的一个或多个病毒颗粒来进行。在一些实施方案中，受试者是患有疼痛的人类患者。
[0016]在一些实施方案中，细胞是自体细胞。或者，细胞可以是异源细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞，例如iPSC细胞或间充质干细胞。在一些实例中，所述方法还可以包括向有需要的受试者(例如，患有疼痛的人类患者)施用具有编辑基因的细胞。
[0017]在本公开的范围内还有本文所描述的任何基因编辑系统或其组分用于治疗疼痛的用途，以及其用于制造供预期医学治疗用的药剂的用途。
[0018]下文描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的细节。本公开的其它特征或优点从若干实施方案的详细描述以及随附权利要求书将显而易见。
附图说明
[0019]以下图式构成本说明书的一部分并且包括在内以进一步展示本公开的某些方面，通过参考这些图式中的一者或多者并结合本文所呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地了解这些方面。应了解，图式中说明的数据决不限制本公开的范围。
[0020]图1A
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1D描绘了不同细胞模型中40个优先化gRNA的目标编辑效率。优先化gRNA包括(图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于修饰钠电压门控通道α亚基9(SCN9A)基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统包含：(a)RNA引导的DNA核酸内切酶或第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码所述RNA引导的DNA核酸内切酶的第一核苷酸序列；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:1
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20中任一者的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的基因编辑系统，其中：(i)(a)的所述RNA引导的DNA核酸内切酶是酿脓葡萄球菌Cas9(SpCas9)；以及(ii)(b)的所述gRNA包含SEQ ID NO:1
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10中任一者的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的基因编辑系统，其中(b)的所述gRNA包含SEQ ID NO:1、3
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5和9中任一者的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的基因编辑系统，其中：(i)(a)的所述RNA引导的DNA核酸内切酶是金黄色葡萄球菌Cas9(SpCas9)；以及(ii)(b)的所述gRNA包含SEQ ID NO:11
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20中任一者的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的基因编辑系统，其中(b)的所述gRNA包含SEQ ID NO:11
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16和18
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20中任一者的核苷酸序列。6.如权利要求1
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5中任一项所述的基因编辑系统，其中(b)的所述gRNA还包含支架序列。7.如权利要求4
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6中任一项所述的基因编辑系统，其中(b)的所述gRNA包含SEQ ID NO:11
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20中任一者的核苷酸序列，并且所述支架序列包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。8.如权利要求1
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7中任一项所述的基因编辑系统，其中(a)中编码所述RNA引导的核酸内切酶的所述第一核苷酸序列还包含编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述RNA引导的DNA核酸内切酶框内融合。9.如权利要求8所述的基因编辑系统，其中所述NLS是SV40NLS。10.如权利要求1
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9中任一项所述的基因编辑系统，其中(a)的所述第一多核苷酸部分和(b)的所述第二多核苷酸部分是不同多核苷酸。11.如权利要求10所述的基因编辑系统，其中所述不同多核苷酸中的至少一者是病毒载体。12.如权利要求11所述的基因编辑系统，其中所述一种或多种病毒载体是一种或多种腺相关病毒(AAV)载体。13.如权利要求1
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12中任一项所述的基因编辑系统，其中单个多核苷酸包含(a)的所述第一多核苷酸部分和(b)的所述第二多核苷酸部分。14.如权利要求13所述的基因编辑系统，其中所述单个多核苷酸是病毒载体。15.如权利要求14所述的基因编辑系统，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。16.一种核酸，所述核酸包含权利要求14所述的单个多核苷酸。17.一种病毒颗粒或病毒颗粒组，所述病毒颗粒或病毒颗粒组集合地包含权利要求1
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15中任一项所述的基因编辑系统。18.如权利要求17所述的病毒颗粒或病毒颗粒组，所述病毒颗粒或病毒颗粒组是一种或多种腺相关病毒(AAV)颗粒。
19.一种编辑钠电压门控通道α亚基9(SCN9A)基因的方法，所述方法包括使细胞与以下接触：(a)权利要求1
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15中任一项所述的基因编辑系统；(b)权利要求16所述的核酸；或者(c)权利要求17或权利要求18所述的病毒颗粒或病毒颗粒组。20.如权利要求19所述的方法，其中所述接触步骤通过向有需要的受试者施用(a)的所述基因编辑系统、(b)的所述核酸或(c)的所述一种或多种病毒颗粒来进行。21.如权利要求20所述的方法，其中所述受试者是患有疼痛的人类患者。22.如权利要求21所述的方法，其中所述细胞是外周神经系统的神经元。23.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞是自体细胞。24.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞是异源细胞。25.如权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述细胞是干细胞。26.如权利要求25所述的方法，其中所述干细胞是iPSC细胞或间充质干细胞。27.如权利要求23
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26中任一项所述的方法，所述方法还包括向有需要的受试者施用所述细胞。28.如权利要求27所述的方法，其中所述受试者是患有疼痛的人类患者。29.一种用于修饰钠电压门控通道α亚基10(SCNA10)基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统包含：(a)RNA引导的DNA核酸内切酶或第...

【专利技术属性】
技术研发人员：S萨伊曼，S卡哈兰，A耶恩，S埃斯帕诺拉，SJ斯宾塞，
申请(专利权)人：沃泰克斯药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：