用于使神经元细胞兴奋性正常化和治疗德拉韦综合征的中间神经元特异性治疗剂制造技术

本发明专利技术提供治疗性病毒载体，尤其是重组腺相关病毒(rAAV)载体，被设计为包含增强子序列，该序列将包含在载体中的效应基因(例如，编码SCN1A的多核苷酸、编码Gq

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使神经元细胞兴奋性正常化和治疗德拉韦综合征的中间神经元特异性治疗剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请为PCT国际申请，主张2019年2月5日提交的美国临时专利申请号US 62/801,483、2019年3月25日提交的美国临时专利申请号US 62/823,281和2019年10月17日提交的美国临时专利申请号US62/916,477的优先权和权益。这些临时专利申请的整体内容通过引用并入本文。
[0003]联邦赞助研究声明
[0004]本专利技术在美国国家卫生研究院拨款(拨款号：MH111529)的支持下完成。政府享有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0005]兴奋与抑制之间存在微妙的平衡。为确保大脑回路的正常运作和在这些回路内运作的神经元细胞的活动，必须小心地维持该平衡。已显示大脑回路系统内兴奋与抑制平衡的改变、缺陷或破坏会导致众多神经系统、神经遗传或神经退行性疾病和病症。此外，缺乏适当的皮层中间神经元功能与神经发育及神经系统疾病和病症相关。
[0006]中间神经元功能和活动的异常或畸变可能是偏离中间神经元发育过程(例如，基因突变导致胚胎发育过程中细胞命运特化畸变)或急性损伤(例如，中风、脑震荡)的结果。GABA能神经传递异常和抑制性皮层回路的改变可能会引起和诱发临床特征和症状，例如癫痫发作(seizure)和癫痫(epilepsy)，令患有诸如德拉韦综合征(Dravet syndrome,DS)和与认知障碍及早产死亡相关的耐药性小儿癫痫等严重神经系统疾病和病症的患者备受折磨。<br/>[0007]由于缺乏能够调节GABA能中间神经元或其他皮层神经元活动且具备特异性与敏感性的治疗组合物和方法，医疗界缓解各类型癫痫病例中癫痫发作的能力受到严重阻碍，尤其是局灶性癫痫发作和DS。因此，急需此类组合物和方法来对抗和治疗这些破坏性极强的病症的严重症状以及其他神经精神性疾病。本文中记载的产品、组合物和方法旨在解决和满足这些需求。

技术实现思路

[0008]本文特征为病毒性载体，尤其是重组腺相关病毒(rAAV)载体、病毒颗粒，以及其组合物和方法。rAAV载体包括(经分子工程改造以包括)至少一种转基因(例如，效应基因诸如经hM3Dq改性的毒蕈碱受体(Gq
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DREADD)等、药理学选择性制动器分子(PSAM)或治疗性基因如SCN1A等)，以及特异性调控多核苷酸序列，其将前述转基因的表达限制到中间神经元(IN)细胞，尤其是表达小清蛋白的快速尖峰形成(fast
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spiking)GABA能中间神经元(本文简称“PV中间神经元”(PV IN))，或大脑皮层神经元细胞。在一个实施方案中，特异性调控多核苷酸序列衍生自基因SCN1A附近的增强子序列，并将rAAV携带的转基因的表达限制到大脑中表达小清蛋白的快速尖峰形成GABA能中间神经元群中。在一个实施方案中，治疗性基
因为SCN1A。在一个特定的实施方案中，载体特异性地转导SCN1A基因表达不充分或有缺陷的中间神经元细胞，该SCN1A基因编码中间神经元细胞尤其是皮层中间神经元细胞内的氯化钠通道Nav1.1；而且，载体使SCN1A缺乏或有缺陷的中间神经元的兴奋性正常化，从而缓解患有德拉韦综合征的受试者的癫痫发作和发作症状。
[0009]在本专利技术的一个方面，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或者尤其是rAAV载体，用于限制转基因在哺乳动物的表达PV的GABA能中间神经元、或锥体(PYR)神经元、或表达血管活性肠肽(VIP)的皮层中间神经元内的表达，并且包括本文所述的增强子元件多核苷酸(本文中又称“调控元件”)。在一个实施方案中，该增强子元件以顺式提供。在一个实施方案中，该调控元件为本文所述的S5E1、S5E2、S5E3、S5E4、S5E5、S5E6、S5E7、S5E8、S5E9或S5E10，尤其是人类E1至E10。在一个实施方案中，该增强子元件为本文所述的E11至E35。在一个实施方案中，该增强子元件为S5E1(E1)。在一个实施方案中，该增强子元件为S5E2(E2)。在一个实施方案中，该增强子元件为S5E3(E3)。在一个实施方案中，该增强子元件为S5E4(E4)。在一个实施方案中，该增强子元件为E5。在一个实施方案中，该增强子元件为E6。在一个实施方案中，该增强子元件为E11。在一个实施方案中，该增强子元件为E14。在一个实施方案中，该增强子元件为E22。在一个实施方案中，该增强子元件为E29。
[0010]在一方面，包括增强子的该病毒性载体或rAAV载体促进SCN1副本在表达PV的转导中间神经元细胞内的表达，从而处置和治疗DS。在其他实施方案中，包括增强子的该载体或rAAV载体促进效应基因的表达，诸如Gq
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DREADD受体，或例如药理学选择性制动器分子(PSAM)、正交配体门控离子通道(以及其药理学选择性效应子分子(PSEM))，用于PV
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中间神经元活性的化学遗传调节，从而治疗所有类型的癫痫，包括局灶性和药理学顽固性癫痫，以及DS。
[0011]在一方面，提供了病毒性载体，其包括转基因多核苷酸序列和将该转基因的表达特异性地限制到表达小清蛋白(PV)的脑部中间神经元细胞的增强子多核苷酸序列。
[0012]在一方面，提供了病毒性载体，其包括与SCN1A基因表达特异性地相关的增强子多核苷酸序列以及转基因多核苷酸序列，其中该增强子序列将转基因的表达限制到表达PV的脑部中间神经元细胞。
[0013]在一方面，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或者尤其是重组腺相关病毒性载体，用于将转基因的表达限制到哺乳动物脑部的表达血管活性肠肽的GABNA能皮层中间神经元细胞(VIP cIN)。在这些皮层中间神经元细胞内以顺式提供如本文描述的增强子元件。在一个实施方案中，该增强子元件为本文所述的S5E6。
[0014]在一方面，合适的病毒性载体，例如慢病毒载体或者尤其是重组腺相关病毒性载体，用于将转基因的表达限制到哺乳动物脑部的GABA能中间神经元和谷氨酰胺能锥体神经元。这些神经元内以顺式提供如本文所述的增强子元件。在一个实施方案中，前述锥体神经元位于哺乳动物脑部的第5皮层。在一个实施方案中，将转基因表达限制到锥体神经元的前述增强子元件为本文中记载的S5E5。
[0015]在上述方面的病毒性载体的实施方案中，该转基因为报告基因、编码只能由人工设计的药物激活的人工设计受体(DREADD)的基因、编码药理学选择性制动器分子(PSAM)的基因，或治疗性基因如SCN1A。在一个实施方案中，该转基因为SCN1A基因。在一个实施方案中，该转基因为DREADD编码的多核苷酸。在一个实施方案中，该编码DREADD的多核苷酸为编
码Gq
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DREADD的基因，其由趋化原氯氮平
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氧化物(CNO)激活。在一个实施方案中，该转基因为编码药理学选择性制动器分子(PSAM)的基因。在一个实施方案中，被表达的PSAM特异性地与PS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种病毒性载体，包括转基因多核苷酸序列和增强子多核苷酸序列，所述增强子多核苷酸序列将所述转基因的表达特异性地限制在大脑的表达小清蛋白(PV)的中间神经元细胞中。2.一种病毒性载体，包括与SCN1A基因表达特异性地相关联的增强子多核苷酸序列，以及转基因多核苷酸序列，其中所述增强子序列将所述转基因的表达限制在大脑的表达PV的中间神经元细胞中。3.根据权利要求1或2所述的病毒性载体，其中，所述转基因是报告基因、编码只能由人工设计的药物激活的人工设计受体(DREADD)的基因、编码药理学选择性制动器分子(PSAM)的治疗性基因，或治疗性基因。4.根据权利要求1至3中任一项所述的病毒性载体，其中，所述转基因是SCN1A基因。5.根据权利要求1至3中任一项所述的病毒性载体，其中，所述转基因是编码DREADD的基因。6.根据权利要求5所述的病毒性载体，其中，所述编码DREADD的基因是由趋化原氯氮平
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N4
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氧化物(CNO)激活的编码Gq
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DREADD的基因。7.根据权利要求3所述的病毒性载体，其中，所述转基因是编码药理学选择性制动器分子(PSAM)的治疗性基因。8.根据权利要求1至7中任一项所述的病毒性载体，其中，所述病毒性载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。9.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，包括SCN1A转基因多核苷酸序列或其功能部分，以及将所述SCN1A转基因的表达特异性地限制到大脑中间神经元或神经元细胞的增强子多核苷酸序列。10.根据权利要求4或权利要求9所述的rAAV载体，其中，由所述SCN1A转基因编码的Nav1.1钠通道在所述rAAV载体转导中间神经元细胞后功能性地表达在所述中间神经元细胞中。11.根据权利要求1至10中任一项所述的病毒性或rAAV载体，其中所述中间神经元细胞是GABA能中间神经元细胞。12.根据权利要求9所述的rAAV载体，其中，所述中间神经元细胞是位于大脑端脑内的GABA能中间神经元细胞。13.根据权利要求11所述的rAAV载体，其中，所述GABA能中间神经元细胞表达小清蛋白(PV)。14.根据权利要求9至11中任一项所述的rAAV载体，其中，所述GABA能中间神经元细胞表达血管活性肠肽(VIP)。15.根据权利要求9至11中任一项所述的rAAV载体，其中，神经元细胞是大脑皮层锥形(PYR)神经元。16.根据权利要求1至13中任一项所述的病毒性或rAAV载体，其中所述增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个长度约100bp或以上的区域，其与人类增强子元件E1、E2、E3、E4、E7、E8、E9或E10的多核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:15至18或21至24)具有至少75％或以上的序列同一性。17.根据权利要求1至13中任一项所述的病毒性或rAAV载体，其中所述增强子多核苷酸
序列包括所述人类增强子元件E1、E2、E3、E4、E7、E8、E9或E10的多核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:15至18或21至24)。18.根据权利要求13所述的病毒性或rAAV载体，其中，所述增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个长度约100bp或以上的区域，其与人类增强子元件E2的多核苷酸序列(SEQ ID NO:16)具有至少75％或以上的序列同一性。19.根据权利要求14或权利要求15所述的rAAV载体，其中，所述增强子多核苷酸序列包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个长度约100bp或以上的区域，其与人类增强子元件E6的多核苷酸序列(SEQ ID NO:20)或人类增强子元件E5的多核苷酸序列(SEQ ID NO:19)具有至少75％或以上的序列同一性。20.根据权利要求19所述的rAAV载体，其中，所述增强子多核苷酸序列包括人类增强子元件E6的多核苷酸序列(SEQ ID NO:20)或人类增强子元件E5的多核苷酸序列(SEQ ID NO:19)。21.根据权利要求1至20中任一项所述的病毒性或rAAV载体，其中所述载体封装长度超过约4.7kb的多核苷酸序列的容量包括通过同源重组或通过受体位点介导的剪接来重排多个rAAV载体。22.根据权利要求4或9至20中任一项所述的病毒性或rAAV载体，其中所述载体将所述SCN1A基因递送至大脑中表达SCN1A的GABA能中间神经元细胞内，而且其中所述SCN1A基因为功能性表达，从而在向受试者施用所述载体后将所述中间神经元细胞内的SCN1A恢复至正常水平。23.根据权利要求22所述的病毒性或rAAV载体，其中，所述受试者是人类患者。24.根据权利要求23所述的病毒性或rAAV载体，其中，所述人类患者是患有德拉韦综合征(DS)的婴幼儿。25.一种病毒性颗粒或病毒样颗粒，包括根据权利要求1至24中任一项所述的病毒性或rAAV载体。26.一种细胞，包括根据权利要求1至24中任一项所述的病毒性或rAAV载体。27.一种细胞，包括根据权利要求25所述的病毒性颗粒或病毒样颗粒。28.一种药物组合物，包括根据权利要求1至24中任一项所述的病毒性或rAAV载体，以及药学可接受的媒介物、载体或稀释剂。29.一种药物组合物，包括权利要求25所述的病毒性颗粒或类病毒样颗粒，以及药学可接受的媒介物、载体或稀释剂。30.根据权利要求28或29所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是液体剂型。31.一种将SCN1A表达水平不足或存在缺陷的GABA能中间神经元细胞或神经元细胞内的SCN1A表达恢复至正常水平的方法，所述方法包括使所述细胞接触有效量的根据权利要求4或9至22中任一项所述的病毒性或rAAV载体、病毒颗粒，或其药物组合物，从而把所述GABA能中间神经元细胞或神经元细胞内的SCN1A表达恢复至正常水平。32.一种治疗已经患有或有风险患有癫痫、癫痫发作或德拉韦综合征(DS)的婴幼儿患有的小儿癫痫和/或癫痫发作的方法，所述方法包括向所述婴幼儿施用治疗有效量的根据权利要求1至24中任一项所述的病毒性或rAAV载体、根据权利要求25所述的病毒性颗粒或病毒样颗粒，或根据权利要求28至30中任一项所述的药物组合物，以治疗所述受试者患有
的癫痫发作、癫痫或DS。33.一种治疗已经患有或有风险患有德拉韦综合征(DS)的受试者的DS的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求4或9至22中任一项所述的病毒性或rAAV载体、病毒性颗粒或其药物组合物，以治疗所述受试者患有的DS。34.一种抑制或预防已经患有或有风险患有癫痫发作和/或癫痫的受试者患有的癫痫发作和/或癫痫的方法，所述方法包括向所述受试者全身性施用重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述rAAV载体包括SCN1A转基因多核苷酸序列或其功能部分、将所述SCN1A转基因的表达特异性地限制在所述受试者大脑皮层中间神经元细胞或神经元细胞内的增强子多核苷酸序列、以及增强所述载体向中间神经元细胞转导的衣壳。35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中，所述婴幼儿或所述受试者是人类患者。36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中，所述rAAV载体内的所述增强子多核苷酸序列包含一个或多个长度约100bp或以上的区域，其与人类增强子元件E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9或E10的多核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:15至24)具有至少75％或以上的序列同一性。37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述rAAV载体内的所述增强子多核苷酸序列包含一个或多个长度约100bp或以上的区域，其与人类增强子元件E2的多核苷酸序列(SEQ ID NO:16)具有至少75％或以上的序列同一性。38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述增强子多核苷酸序列是人类增强子元件E2的多核苷酸序列SEQ ID NO:16。39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述rAAV载体内的所述增强子多核苷酸序列包含一个或多个长度约100bp或以上的区域，其与人类增强子元件E6的多核苷酸序列(SEQ ID NO:20)或人类增强子元件E5的多核苷酸序列(SEQ ID NO:19)具有至少75％或以上的序列同一性。40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述增强子多核苷酸序列是人类增强子元件E6的多核苷酸序列SEQ ID NO:20或人类增强子元件E5的多核苷酸序列SEQ ID NO:19。41.一种递送转基因的方法，所述转基因用于在表达SCN1A基因的中间神经元细胞或神经元细胞中限制表达，从而抑制或预防有需要的受试者患有的癫痫发作和/或癫痫，所述方法包括使所述细胞接触重组腺相关病毒(rAAV)载体，从而抑制或预防所述受试者患有的癫痫发作和/或癫痫，所述rAAV载体包含SCN1A转基因多核苷酸序列或其功能部分以及将所述SCN1A转基因的表达特异性地限制在所述受试者大脑皮层中间神经元细胞或神经元细胞内的增强子多核苷酸序列。42.根据权利要求31或34至41中任一项所述的方法，其中，所述中间神经元细胞选自表达PV的皮层中间神经元(PV至cIN)、表达血管活性肠肽的去抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会纽约大学，
类型：发明
国别省市：