重新定向AAV衣壳的嗜性制造技术

本公开涉及用于制备、使用和/或配制腺相关病毒衣壳蛋白的组合物、方法和工艺，其中所述衣壳蛋白包含增强对靶组织嗜性的靶向肽插入物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重新定向AAV衣壳的嗜性相关申请的交叉引用本申请要求享有以下的权益：2018年10月2日提交的名称为AAVCAPSIDLIBRARIESANDTISSUETARGETINGPEPTIDEINSERS(AAV衣壳文库和靶向组织的肽插入物)的美国临时专利申请号62/740,310；2019年4月29日提交的名称为REDIRECTIONOFTROPISMAAVCAPSIDS(重新定向AAV衣壳的嗜性)的美国临时专利申请号62/839,883；其各自内容通过引用整体并入本文。对序列表的引用本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为20571060PCTSL.txt的文件形式提供，该文件创建于2019年10月2日，大小为428,491字节。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。公开领域本公开涉及用于制备、使用和/或配制腺相关病毒衣壳蛋白的组合物、方法和工艺，其中所述衣壳蛋白包含增强对靶组织的嗜性的靶向肽插入物。背景将基因递送到成人中枢神经系统(CNS)仍然是基因治疗中的主要挑战，并且具有改善的脑嗜性的工程化AAV衣壳代表了一种有吸引力的解决方案。腺相关病毒(AAV)衍生的载体因其非致病性、低免疫原特征、低整合入宿主基因组的速率以及在非分裂细胞中长期转基因表达而成为临床基因转移的有前途的工具。但是，AAV天然变体在某些器官中的转导效率对于临床应用而言太低，并且通过预先存在的中和抗体进行衣壳中和可能会阻止大部分患者的治疗。由于这些原因，已经做出了巨大的努力来获得具有增强特性的新颖衣壳变体。迄今为止，在许多测试方法中，最显著的进展来自AAV衣壳的定向进化，该过程是通过使用易错PCR、各种亲本血清型改组或在特定位置插入完全随机化的短肽的衣壳序列随机化产生的体外或体内选择衣壳变体而进行的。为了进行AAV衣壳的定向进化，编码病毒衣壳的序列本身两侧带有反向末端重复序列(ITR)，因此可以将其包装到自己的衣壳中。在衣壳的混合种群感染培养的细胞或动物后，通过PCR回收已成功归巢到目标组织中的编码衣壳变体的DNA，以进行进一步的多轮选择。在这种方法中，回收给定组织中存在的所有病毒DNA物质，而无需区分特定的细胞类型或能够进行完全转导的载体(细胞表面结合、内吞、运输、核输入、脱壳、第二链合成、转录)。例如，在包含多种细胞类型的高度复杂的组织(例如中枢神经系统(CNS))的情况下，施加更严格的选择性压力以回收能够转导神经元和/或星形胶质细胞而不是小胶质细胞或血管内皮细胞的衣壳变体是高度优选的。全身施用后改善AAV衣壳的CNS嗜性的尝试已经取得了有限的成功。已经使用了两种先前的方法来解决此问题。使用的第一种策略是将培养细胞(Grimm等，2008)或原位动物组织(Lisowski等，2014)与腺病毒共感染，以触发感染性AAVDNA的指数复制。另一种成功的方法涉及使用细胞特异性CRE转基因小鼠(Deverman等，2016)，从而允许星形胶质细胞中特异性的病毒DNA重组，然后回收CRE重组衣壳变体。两种方法都证明是成功的，可以分离具有增强的靶细胞群转导作用的几种衣壳变体。这一发现表明，细胞类型特异性文库选择可以改善定向进化的结果。但是，Deverman等人使用的转基因CRE系统在其他动物物种中不是易处理的，并且通过在小鼠组织中定向进化选择的AAV变体在大型动物中没有显示出相似的特性。因此，有必要直接在非人类灵长类动物中执行整个定向进化过程，以增加人类受试者可翻译性的可能性。先前描述的转导特异性方法均不适用于大型动物研究，因为：1)许多目标组织(例如，CNS)不容易被腺病毒共感染，2)特定性Ad嗜性本身会使文库分布偏向，并且3)大型动物通常不适合转基因并且不能进行基因工程化以在限定的细胞类型中表达CRE重组酶。为了解决这个问题，我们为非转基因动物中的细胞类型特异性生物淘选开发了广泛适用的功能性AAV衣壳文库筛选平台。在TRACER(通过RNA的细胞类型特异性表达进行的AAV的嗜性再定向，TropismRedirectionofAAVbyCelltype-specificExpressionofRNA)平台系统中，衣壳基因被置于细胞类型特异性启动子的控制下，以在没有辅助病毒共感染的情况下驱动衣壳mRNA表达。该RNA驱动的筛选增加了选择性压力，有利于转导特定细胞类型的衣壳变体。TRACER平台允许生成AAV衣壳文库，从而无需转基因动物或辅助病毒共感染即可实现转导细胞中表达的衣壳mRNA的特异性回收和亚克隆。由于mRNA转录是完全转导的标志，因此这些方法将允许鉴定完全感染的AAV衣壳突变体。除了其较高的严格性外，该方法还允许使用设计用于在任何细胞特异性启动子(例如但不限于突触蛋白-1启动子(神经元)、GFAP启动子(星形胶质细胞)、TBG启动子(肝)、CAMK启动子(骨骼肌)、MYH6启动子(心肌细胞))控制下表达CAPmRNA的文库鉴定特定细胞类型的高嗜性衣壳。公开内容本公开提供了用于工程化和/或重新定向AAV衣壳的嗜性的组合物和方法。本文还提供了可以插入AAV衣壳序列中以增加衣壳对特定组织的嗜性的肽。一方面，所述肽可用于将衣壳靶向脑，或脑或脊髓的区域。本公开提供了用于产生一种或多种变体AAV衣壳多肽的方法。在某些实施方案中，相对于亲本AAV衣壳多肽，变体AAV衣壳多肽表现出转导改善或细胞或组织特异性增加中的至少一种。在某些实施方案中，该方法包括：(a)产生变体AAV衣壳多肽文库，其中所述文库包括(i)具有2、3、4、5、6、7、8或9个连续氨基酸的随机序列区的多个衣壳多肽，或(ii)来自多于一个亲本AAV衣壳多肽的多个衣壳多肽；(b)通过将文库(a)(i)或(a)(ii)的衣壳多肽克隆到AAV载体中来产生AAV载体文库，其中所述AAV载体包括第一启动子和第二启动子，其中所述第二启动子在没有辅助病毒共感染的情况下驱动衣壳mRNA的表达。在某些实施方案中，第一启动子是AAV2P40。在某些实施方案中，第二启动子是遍在启动子。在某些实施方案中，第一启动子是AAV2P40，且第二启动子是遍在启动子。在某些实施方案中，第一启动子是AAV2P40。在某些实施方案中，第二启动子是细胞类型特异性启动子。在某些实施方案中，第一启动子是AAV2P40，且第二启动子是细胞类型特异性启动子。在某些实施方案中，启动子选自表3中列出的任何启动子。在某些实施方案中，遍在启动子或细胞特异性启动子允许表达编码衣壳多肽的RNA。在某些实施方案中，该方法包括回收编码衣壳多肽的RNA。在某些实施方案中，该方法包括确定衣壳多肽的序列。在某些实施方案中，与亲本衣壳多肽相比，回收的衣壳多肽表现出靶细胞转导或靶细胞特异性(嗜性)增加。在某些实施方案中，靶细胞是神经元细胞、神经干细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、视网膜细胞、肿瘤细胞、造血干细胞、产生胰岛素的β细胞、肺上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、肌肉干细胞、肌肉卫星细胞或心肌细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生变体AAV衣壳多肽的方法，其中相对于亲本AAV衣壳多肽，所述变体AAV衣壳多肽表现出改善的转导或增加的细胞或组织特异性中的至少一种，所述方法包括：/na)产生变体AAV衣壳多肽的文库，其中所述文库包括/ni)具有2、3、4、5、6、7、8或9个连续氨基酸的随机化序列区的多个衣壳多肽，或/nii)来自多于一个亲本AAV衣壳多肽的多个衣壳多肽；/nb)通过将文库(i)或(ii)的衣壳多肽克隆到AAV载体中来产生AAV载体文库，其中所述AAV载体包括第一启动子和第二启动子，其中所述第二启动子在没有辅助病毒共感染的情况下驱动衣壳mRNA表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181002 US 62/740,310;20190429 US 62/839,8831.一种产生变体AAV衣壳多肽的方法，其中相对于亲本AAV衣壳多肽，所述变体AAV衣壳多肽表现出改善的转导或增加的细胞或组织特异性中的至少一种，所述方法包括：
a)产生变体AAV衣壳多肽的文库，其中所述文库包括
i)具有2、3、4、5、6、7、8或9个连续氨基酸的随机化序列区的多个衣壳多肽，或
ii)来自多于一个亲本AAV衣壳多肽的多个衣壳多肽；
b)通过将文库(i)或(ii)的衣壳多肽克隆到AAV载体中来产生AAV载体文库，其中所述AAV载体包括第一启动子和第二启动子，其中所述第二启动子在没有辅助病毒共感染的情况下驱动衣壳mRNA表达。


2.如权利要求1所述的方法，其中第一启动子是AAV2P40，并且第二启动子是遍在启动子。


3.如权利要求1所述的方法，其中第一启动子是AAV2P40，并且第二启动子是细胞类型特异性启动子。


4.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中启动子选自表3中列出的任何启动子。


5.如权利要求4所述的方法，其中遍在启动子或细胞特异性启动子允许编码衣壳多肽的RNA的表达。


6.如权利要求5所述的方法，还包括回收编码衣壳多肽的所述RNA并确定所述衣壳多肽的序列。


7.如权利要求6所述的方法，其中与亲本衣壳多肽相比，回收的衣壳多肽表现出增加的靶细胞转导或靶细胞特异性(嗜性)。...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·E·农嫩马赫，侯金兆，王伟，K·安达，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US