转基因的瘟病毒及其作为标记疫苗的应用制造技术

在第一方面中，本发明专利技术涉及一种经基因修饰的瘟病毒，其特征在于，所述瘟病毒被修饰为，使得至少对于E

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转基因的瘟病毒及其作为标记疫苗的应用
在第一方面中，本专利技术涉及一种基因修饰的瘟病毒，其特征在于，所述瘟病毒被修饰为，使得至少对于Erns肽编码的基因片段源自一种或多种与经基因修饰的瘟病毒远缘的瘟病毒。在另一方面中，描述了一种受感染的宿主细胞或其细胞培养上清液，所述细胞培养上清液包含根据本专利技术进行基因修饰的瘟病毒。此外，本专利技术涉及一种疫苗及其应用以及经基因修饰的瘟病毒作为疫苗的应用，尤其作为用于动物的疫苗以及作为抗典型猪瘟(KSP)、牛病毒性腹泻(BVD)、边界病(BD)以及其它通过瘟病毒引起的疾病的疫苗。此外，描述了一种重组嵌合Erns肽以及一种用于检测瘟病毒或由其诱导产生的抗体的检测系统，尤其用于区分接种的动物和自然感染瘟病毒之后的动物。最后描述了一种方法，所述方法用于确定动物已用根据本专利技术的疫苗进行接种疫苗的程度，以及对此的诊断试剂盒，和一种用于控制在偶蹄目的动物种群中的瘟病毒感染的方法。
技术介绍
典型猪瘟(KSP)由RNA病毒(典型猪瘟病毒；KSPV)引起，该RNA病毒属于黄病毒科家族中的瘟病毒属。其是世界范围内最重要的动物病原体之一。用减毒的KSPV分离株进行接种引起快速而持久的免疫力。在世界范围内最广泛使用的金标准疫苗基于所谓的“C株”疫苗病毒的变体。然而在接种后或在野外感染幸存之后无法对免疫响应进行血清学区分。该事实一方面使克服KSP变难，因为不能在已接种的种群中使用血清学方法，另一方面，这也具有严重的经济后果，因为被接种的动物不再能够或者难以投向市场，并且迫使采取广泛的贸易限制。能够实现在接种的动物和被自然感染(野外感染)/在自然感染(野外感染)之后的动物之间进行区分的疫苗能够解决该问题。这种疫苗也称为标记疫苗或DIVA疫苗(DIVA：differentiationinfectedfromvaccinatesanimals)。对于在牛中的另一经济上重要的动物疾病，即牛病毒性腹泻(BVD)，该情况是类似的。牛病毒性腹泻同样通过瘟病毒，即牛病毒性腹泻病毒(BVDV)触发，并且标记疫苗在此也能够提供下述可行性：借助于血清学方法区分接种的牛和感染的牛。通常，在瘟病毒感染的情况下，例如用KSPV或BVDV诱导产生针对糖基化的包膜蛋白质E2和Erns的以及针对非结构蛋白质NS3的免疫响应。尤其，中和所述病毒的E2特异性抗体在保护性免疫响应中起关键作用，进而形成研发抵抗KSP、BVD和其它因瘟病毒引起的疾病的相应的标记疫苗的基础。DIVA原理主要基于检测有抵抗瘟病毒Erns的抗体。用基于E2的标记疫苗进行免疫的动物构成保护性的E2特异性免疫响应，并且Erns抗体是阴性的。该原理同样适用于不同的瘟病毒，如BVDV和KSPV。因此，该策略包括借助于基因技术制造嵌合瘟病毒来制造标记疫苗。为此，将对于上述三种蛋白质之一进行编码的基因组区域通过近缘的瘟病毒的同源序列来替换。在过去已产生大量不同的嵌合瘟病毒，并且部分地已经检查其作为标记疫苗的适用性。示例性地，在此参考WO2016/176624A2和WO2016/097245A1。尤其地，不存在Erns编码序列或其被其它瘟病毒的同源序列替换是用于研发血清学阴性标记的有前途的策略。但是，对于制造活疫苗，删除Erns编码序列是不可行的，因为其是瘟病毒的必不可少的蛋白质。在不久前，欧洲药品管理局(EMA)在全球范围内首次批准了嵌合瘟病毒作为KSP标记疫苗，对此涉及德国Zoetis的CSF标记。在这种情况下同样是血清学阴性标记的策略，该策略基于缺乏针对KSPV的Erns蛋白质的免疫响应。在此，如下改变牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分离株：BVDV的E2基因被猪瘟病毒分离株的E2基因取代，使得嵌合瘟病毒诱导产生针对KSPV的E2蛋白质的保护性抗体，也参见Reimann等，2004，Virology，322，143-157页。在多项研究中表明：虽然能够实现非常好的保护作用，然而在不同的血清学测试中能够观察到相对高的假阳性结果，使得仅能够受限地识别在接种种群中的野外感染，例如参见Meyer等，2017，TransboundEmergDis，64(6)：2013-2022和Meyer等，2018，TransboundEmergDis，65(2)：e505-e508。所观察到的假阳性反应可能通过血清学交叉反应性引起，因为BVDV和KSPV在基因学和抗原学上彼此非常近缘。除了假阳性结果之外，在动物传染病法上重要的相对于猪感染反刍动物的瘟病毒(Pestivierender)，如BVDV或边界病病毒(BDV)来区分猪感染KSPV在使用时引起问题，因为疫苗基于BVDV分离株“CP7”。对于BVD至今为止没有批准标记疫苗。描述了携带叉角羚瘟病毒的Erns序列的嵌合BVD病毒(Luo等，2012)。至今为止尚未描述在CSFV疫苗的情况下使用叉角羚Erns的应用以及关于在动物物种即猪中产生KSPV嵌合体和关于针对这种疫苗病毒的免疫响应的实验数据。除E2以外，Erns蛋白质(氨基酸数量：227)属于KSPV免疫原性结构蛋白质，并且还具有以下特性：·Erns具有核糖核酸酶活性；·Erns的分子质量的一半归因于糖基化；·膜结合经由C末端两性分子螺旋式进行；·糖基化包膜蛋白质Erns的分子结构初次由LangedijkJ.P.，JVirol，2002，76，10383-10392描述；·Erns的抗原结构借助于表位作图研究更详细地描述。Erns的表位在此越来越不连续地存在。至今的嵌合瘟病毒的关于鲁棒的DIVA设计理念的基本问题是在针对典型的反刍动物瘟病毒如BVDV和BDV的抗体与KSPV特异性抗体之间的血清学交叉反应性。在基因学上近缘的瘟病毒存在高度的血清学交叉反应性。在过去几年中已发现多种新的“非典型”瘟病毒，所述“非典型”瘟病毒在基因学上与上述典型的瘟病毒(例如KSPV、BVDV、BDV和HoBi样瘟病毒)极度不同。在WO2017/114778A1中描述的瘟病毒标记疫苗的特征在于，Erns蛋白质是嵌合Erns蛋白质，其中其编码基因在5’区域中源自下述瘟病毒，所述瘟病毒在基因学上与改变的瘟病毒近缘关系很少，并且在3’末端处具有Erns基因的相应的基因片段，该基因片段源自与改变的瘟病毒非常近缘的瘟病毒。为此，在该文献中进一步解释，通过在基因学上远缘的瘟病毒的异源Erns完全替换瘟病毒中的原始Erns会要么强烈减少要么甚至停止所获得的嵌合瘟病毒的复制。该文献教导：通过远缘的瘟病毒中的Erns基因完全替换待修饰的瘟病毒的Erns基因在病毒复制方面进而在活疫苗的制造和繁殖方面是非常不利的。尤其地，远缘的瘟病毒的Erns序列将会使上文提及的血清学交叉反应性问题最小化，进而显着改进在动物疾病防控中作为血清学阴性标记的用途。
技术实现思路
目的是提供一种瘟病毒，所述瘟病毒适合作为标记疫苗的并且具有关于Erns蛋白质与典型的瘟病毒(例如KSPV、BVDV、BDV)的较低的血清学交叉反应性。在第一方面中，下述专利技术涉及基因修饰的瘟病毒，其中将瘟病毒的Ern本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经基因修饰的瘟病毒，其中将所述瘟病毒的E

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180427 DE 102018110208.91.一种经基因修饰的瘟病毒，其中将所述瘟病毒的Erns编码基因修饰为，使得至少Erns蛋白质编码基因片段源自与经基因修饰的瘟病毒远缘的至少一种瘟病毒。


2.根据权利要求1所述的经基因修饰的瘟病毒，其中所述Erns蛋白质编码基因片段是嵌合的Erns基因片段，所述嵌合的Erns基因片段由与经基因修饰的瘟病毒远缘的不同瘟病毒的两个或多个Erns基因片段构成。


3.根据上述权利要求中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒，其特征在于，所述经基因修饰的瘟病毒选自：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；典型猪瘟病毒(KSPV)、HoBi样瘟病毒和边境病病毒(BDV)。


4.根据上述权利要求中任一项所述的基因修饰的瘟病毒，其特征在于，基因学上远缘的瘟病毒中的Erns基因片段是下述瘟病毒的Erns基因片段，所述瘟病毒选自：叉角羚瘟病毒、Bungowannah病毒、LINDA病毒、大鼠瘟病毒、非典型猪瘟病毒(APPV)和蝙蝠瘟病毒。


5.根据权利要求4所述的经基因修饰的瘟病毒，其中所述瘟病毒选自KSPV和BVDV。


6.根据上述权利要求中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒，其特征在于，所述嵌合的Erns基因片段借助于所述大鼠瘟病毒的Erns基因片段中的一部分和所述叉角羚瘟病毒的Erns基因片段的一部分来制造，尤其其中所述叉角羚瘟病毒的Erns基因片段位于3’末端。


7.根据权利要求6所述的经基因修饰的瘟病毒，所述经基因修饰地瘟病毒包含下述嵌合的Erns基因片段，所述嵌合的Erns基因片段具有与所述大鼠瘟病毒中的Erns基因片段的5’基因片段相对应的5’基因片段和与所述叉角羚瘟病毒中的Erns基因片段的3’基因片段相对应的3’基因片段，尤其是具有根据SEQIDNO.1的序列的Erns基因片段。


8.根据上述权利要求中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒，其特征在于，所述经基因修饰的瘟病毒是减毒的瘟病毒。


9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括根据权利要求1至8中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒。


10.一种组合物，所述组合物包括根据权利要求9所述的宿主细胞或根据1至8中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒或其如下组分，所述组分至少包括如在权利要求1至8中任一项中所限定的Erns基因片段或通过所述Erns基因片段编码的多肽。


11.一种用于动物的疫苗，尤其是用于偶蹄目动物如猪或牛的疫苗，其包括根据权利要求1至8中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒或根据权利要求9所述的宿主细胞，或根据权利要求10所述的组合物或其组合，以及在药理学上可接受的载体材料。


12.一种根据权利要求1至8中任一项所述的经基因修饰的瘟病毒的应用，用于预防或减少瘟病毒感染或用于减少在所述动物中由瘟病毒诱发的疾病的相应的病症。


13.一种重组的嵌合的Erns多肽，其具有N末端片段和C末端片段，其中所述N末端片段和所述C末端片...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·贝歇尔，亚历山大·波斯特尔，
申请(专利权)人：汉诺威兽医学院基金会，
类型：发明
国别省市：德国;DE