促转导素-D－改良的基因转移增强剂制造技术

本发明专利技术涉及具有序列Z

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】促转导素-D－改良的基因转移增强剂本申请涉及改进的基因转移增强剂(即促转导素D(PTD-D)，其是对转导增强剂PTD-A和PTD-B的改进)，并且涉及其多肽，并且涉及其N末端保护的多肽，并且涉及包含所述多肽的药物，并且涉及所述多肽在基因治疗中的应用，并且涉及用于增强基因工程病毒构建体对细胞的感染的方法以及所述多肽用于转染或转导扩增的用途。自克隆第一个人类基因并重组生产以来，用于改变特定细胞功能的遗传物质的引入已成为生物医学基础和应用研究中必不可少的工具。基因导入方法不断进步，促使基因转移的优化。对转导增强剂的开发研究使得促转导素-A被发现，这是一种来自HIV病毒包膜蛋白的肽。令人惊讶的是，它适合于以前所未有的程度提高基因材料进入核内的慢病毒转导(Yolamanova等人，自然·纳米技术)。因此，可以证明，例如，与金标准“重组人纤维蛋白片段(retroectin)”相比，以不同浓度(1-100μg/ml)的促转导素-A(同义词：EF-C)预温育的HIV对报告细胞的感染率增加了十的几次方倍。作为作用机理，假定EF-C形成能够结合和浓缩病毒并因此放大病毒进入细胞的纤维结构。除感染病毒颗粒外，EF-C还可以在基因治疗中广泛应用的多种人类细胞类型(T细胞、胶质细胞、成纤维细胞、造血干细胞)中高效增强慢病毒和逆转录病毒颗粒的转导(JanMünch等人，自然·纳米技术，第8卷，第2期，第130-136页)。EP2452947A1也涉及促转导素A。半胱氨酸属于极性中性氨基酸。此外，由于其独特的功能性硫醇基团，因此半胱氨酸是一种从未被考虑过修饰或甚至被另一种氨基酸，尤其是来自另一组氨基酸的取代的氨基酸。像Cys一样，Tyr、Asp、Ser、Gly、Gln、Thr是一部分极性但中性的氨基酸。但是，本领域技术人员会回避用其他组的氨基酸取代，因为这种取代对通过交换修饰的肽的二级结构的影响是难以预见的。因此，本领域技术人员不会考虑用非极性疏水性氨基酸组中的氨基酸取代促转导素的Cys。然而，现在令人惊讶地发现，促转导素中的氨基酸Cys可以被丙氨酸取代，而不会导致修饰的多肽作为转导增强剂的有效性发生显著变化。根据本专利技术，提供了一种修饰的促转导素，其一方面具有与PTD-A作为转导增强剂相当的功效，还具有更高的储存稳定性，并且确保了在其作为转导增强剂的应用中的操作更简单，这是GMP生产中的巨大优势。本专利技术的多肽与如下序列具有至少80％或90％的序列同一性，尤其是95％的序列同一性Z1-Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2。Z1彼此独立地是多肽的N末端，或彼此独立地是氨基酸Leu或Ser，或以下肽：Ser-Asn、Ser-Asn-Asn、Ser-Asn-Asn-Ile、Ser-Asn-Asn-Ile-Thr、Thr-Leu、Ile-Thr-Leu、Asn-Ile-Thr-Leu、Asn-Asn-Ile-Thr-Leu、或Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu，Z2彼此独立地为多肽的C末端，或彼此独立地为氨基酸Gly或Glu或以下肽：Glu-Val、Glu-Val-Gly、Glu-Val-Gly-Lys、Glu-Val-Gly-Lys-Ala、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Glu-Gly、Ile-Glu-Gly、Pro-Ile-Glu-Gly、Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、或Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly。通过本专利技术的多肽可以实现的提高涉及转导增强剂的增加的稳定性，其可以用于治疗用途。用于治疗应用的细胞中有效的基因转导可以减少例如用于基因转导的病毒颗粒的所需量。此外，可以减少有效转导所需的感染周期数。通过使用本专利技术的多肽作为转导增强剂，可以减少用于增殖基因修饰的细胞的体外培养的持续时间和要从患者中去除的细胞的量(例如，通过血细胞去除术)，并且在某些情况下，可以通过减少体内病毒载量来实现有效且无毒的体内基因转导。此外，高效的转导增强剂的快速处理可减少待转导细胞的负荷。由于其提高的稳定性，即使在物质的长时间储存之后，本专利技术的多肽也可以更好地预测转导增强剂的有效性。由于其更高的稳定性，与PTD-A相比，本专利技术的多肽还可生产更大的肽批次，其可以被存储更长的时间。与PTD-A相比，本专利技术的多肽的反应性较低，使其具有较低的细胞毒活性。在转导中，这使得转导细胞具有更高产量。具体地，本专利技术涉及与如下序列具有至少80％序列同一性，尤其是90％序列同一性的多肽Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln。根据本专利技术，术语“本专利技术的多肽”还包括通过改变本专利技术的多肽的多肽链中的氨基酸而形成的，但是仍然具有相当的且足够的效力的那些相关多肽，其可以例如，在以下生物测定中确定。可以例如通过使用富含原代活化的CD4+/CD8+的T细胞来测试转导效率，原代活化的CD4+/CD8+的T细胞与作为靶细胞的CD3/CD28珠子、以及编码绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒和逆转录病毒载体培养3天。可以例如针对作为转导增强剂的金标准的PTD-A和Retronectin测试PTD-D。在测定中采用例如25μg/ml的PTD-A和PTD-D。靶细胞以特别是103至106细胞/ml的浓度使用。将混合物孵育8至16小时，然后洗涤细胞。然后，将细胞培养例如另外4天。然后，在第7天，通过流动离心确定GFP+T细胞的比例，并确定细胞计数和活力。具体地，同源肽是与本专利技术的多肽的序列有关的多肽，其中氨基酸的替换或缺失以所述程度进行。具体地，可以交换具有相似性质，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于，与如下序列具有至少80％或90％序列同一性，尤其是95％序列同一性/nZ

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170829 EP 17188384.61.一种多肽，其特征在于，与如下序列具有至少80％或90％序列同一性，尤其是95％序列同一性
Z1-Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2，
其中，
Z1代表多肽的N末端，或彼此独立的是氨基酸Leu或Ser，或以下肽：
Ser-Asn、Ser-Asn-Asn、Ser-Asn-Asn-Ile、Ser-Asn-Asn-Ile-Thr、Thr-Leu、Ile-Thr-Leu、Asn-Ile-Thr-Leu、Asn-Asn-Ile-Thr-Leu、或Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu，
Z2代表多肽的C末端，或彼此独立地是氨基酸Gly或Glu或以下肽：
Glu-Val、Glu-Val-Gly、Glu-Val-Gly-Lys、Glu-Val-Gly-Lys-Ala、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu、Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Glu-Gly、Ile-Glu-Gly、Pro-Ile-Glu-Gly、Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly、Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-G...

【专利技术属性】
技术研发人员：WG·福斯曼，R·里克特，
申请(专利权)人：法瑞斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE