AAV衣壳的向性的重定向制造技术

本公开涉及用于制备、使用和/或配制腺相关病毒衣壳蛋白的组合物、方法和工艺，其中所述衣壳蛋白包含靶向肽插入物以获得针对靶组织的增强的向性。织的增强的向性。织的增强的向性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AAV衣壳的向性的重定向
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年5月13日提交的美国临时申请63/023,927和2020年12月7日提交的美国临时申请63/122,300的优先权，所述申请的全部内容由此以引用的方式并入。
[0003]序列表的引用
[0004]本申请与呈电子格式的序列表一起提交。所述序列表是以2021年3月31日创建的标题为2057_1119PCT_SL的文件形式提供，所述文件的大小为7,087,883字节。所述电子格式的序列表中的信息以全文引用的方式并入本文中。
专利

[0005]本公开涉及用于制备、使用和/或配制腺相关病毒衣壳蛋白的组合物、方法和工艺，其中所述衣壳蛋白包含例如靶向肽插入物的肽以获得针对靶细胞或组织的增强的向性。

技术介绍

[0006]向成人中枢神经系统(CNS)的基因递送仍为基因疗法中的重大难题。具有改进的脑向性的经工程改造的腺相关病毒(AAV)衣壳代表对CNS递送的限制的有吸引力的解决方案。
[0007]AAV衍生的载体由于其非病原性性质、其低免疫原性概况、宿主基因组中的低整合速率和非分裂细胞中的长期转基因表达而为用于临床基因转移的有前景工具。然而，某些器官中AAV天然变体的转导效率对于临床应用来说过低，并且通过预先存在的中和抗体进行的衣壳中和可能会阻碍大比例患者的治疗。出于这些原因，已付出相当大的努力来获得具有增强特性的新颖衣壳变体。在迄今所测试的许多方法中，使用衣壳变体的体外或体内选择进行的AAV衣壳的定向演化已产生重大进展，所述衣壳变体是通过使用易错PCR进行的衣壳序列随机化、各种亲本血清型的改组或所界定位置处完全随机化短肽的插入而产生。
[0008]在全身施用时提供具有例如改进的针对靶细胞或组织的向性的改进的特性的AAV衣壳的尝试已取得有限成功。因此，需要产生AAV衣壳的改进方法，并且所得AAV衣壳用于将所关注的有效载荷递送至例如CNS细胞或组织或肌肉细胞或组织的靶细胞或组织。

技术实现思路

[0009]本公开至少部分涉及用于产生并且使用包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的组合物和方法。在一些实施方案中，对于例如CNS组织、CNS细胞、肌肉组织或肌肉细胞的组织或细胞，AAV衣壳变体具有增强的向性。所述向性可适用于将例如本文所述的有效载荷的有效载荷递送至细胞或组织、适用于治疗例如神经或神经系统变性病症、肌肉或神经肌肉病症或神经肿瘤病症的病症。
[0010]因此，一方面，本公开提供例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽，所述AAV衣壳多肽包含：SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸序列存在于环VIII中。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。在一些实施方案中，所述AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3636
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3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。
[0011]另一方面，本公开提供例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽，所述AAV衣壳多肽包含：具有插入物的亲本氨基酸序列，其中所述插入物包含SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述亲本序列包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列；和/或SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入物存在于所述亲本氨基酸序列的环VIII中，例如插入其中。在一些实施方案中，所述插入物紧随所述亲本序列的位置586、588或589之后存在，例如插入。在一些实施方案中，所述AAV衣壳变体还包含所述亲本氨基酸序列的位置587处的缺失和/或位置588处的缺失。
[0012]另一方面，本公开提供肽(例如靶向肽)，所述肽包含：至少SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列的3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽由以下编码：SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核酸序列；或包含SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码所述肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核酸序列或包含SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
[0013]另一方面，本公开提供编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸，其中所述AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:1725
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3622或3648
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(a)SEQ ID NO:1725
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3622或3648
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3659中的任一者的氨基酸序列；或(b)来自SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；任选地，其中所述衣壳变体包含：(i)SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或(ii)具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的AAV衣壳变体，其中所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。3.如权利要求1或2所述的AAV衣壳变体，其中：(i)所述5个连续氨基酸包含PLNGA(SEQ ID NO:3679)；(ii)所述6个连续氨基酸包含PLNGAV(SEQ ID NO:3680)；(iii)所述7个连续氨基酸包含PLNGAVH(SEQ ID NO:3681)；(iv)所述8个连续氨基酸包含PLNGAVHL(SEQ ID NO:3682)；和/或(v)所述9个连续氨基酸包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)；任选地，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。4.如权利要求1或2所述的AAV衣壳变体，其中：(i)所述5个连续氨基酸包含YSTDE(SEQ ID NO:3691)或YSTDV(SEQ ID NO:3700)；(ii)所述6个连续氨基酸包含YSTDER(SEQ ID NO:3692)或YSTDVR(SEQ ID NO:3701)；和/或(iii)所述7个连续氨基酸包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、YSTDERM(SEQ ID NO:3657)或YSTDERK(SEQ ID NO:3658)；任选地，其中(i)、(ii)或(iii)的所述氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。5.如权利要求1或2所述的AAV衣壳变体，其中：(i)所述5个连续氨基酸包含IVMNS(SEQ ID NO:3694)；(ii)所述6个连续氨基酸包含IVMNSL(SEQ ID NO:3695)；和/或(iii)所述7个连续氨基酸包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)，任选地，其中(i)、(ii)或(iii)的所述氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。6.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列，其中所述PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在；(ii)GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列，其中所述GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置
586之后存在；(iii)IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列，其中所述IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在；或(iv)SEQ ID NO:3649、3650、3652、3653或3655
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3659中的任一者的氨基酸序列，其中前述序列中的任一者的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。7.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中：(i)所述衣壳变体包含由SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(ii)所述衣壳变体包含由包含SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(iii)编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或(iv)编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660
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3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。8.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中：(i)所述衣壳变体还包含根据SEQ ID NO:138编号的位置K449处的取代，例如K449R取代；(ii)所述衣壳变体还包含环I、II、IV和/或VI中的修饰，例如插入、取代和/或缺失；(iii)所述衣壳变体包含根据SEQ ID NO:138编号的位置587处除“A”以外的氨基酸残基和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸残基；(iv)所述衣壳变体包含具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列；(v)所述衣壳变体包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；(vi)所述衣壳变体包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码的氨基酸序列；和/或(vii)编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。9.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白或其组合；(ii)对应于SEQ ID NO:3636
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3647中的任一者的位置138
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743的的氨基酸序列，例如VP2，或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；(iii)对应于SEQ ID NO:3636
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3647中的任一者的位置203
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743的氨基酸序列，例如
VP3，或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；(iv)SEQ ID NO:3636
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3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；(v)具有SEQ ID NO:3636
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3647中的任一者的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列；(vi)由SEQ ID NO:3623
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3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。10.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3623
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3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列，任选地，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列经密码子优化。11.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)如权利要求1
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3或6
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10中任一项所述的氨基酸序列，并且还包含与SEQ ID NO:3636至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:3636的氨基酸序列。12.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)如权利要求1、2、4或6
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10中任一项所述的氨基酸序列，并且还包含与SEQ ID NO:3638或3645
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3646至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:3638或3645
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3646的氨基酸序列。13.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)如权利要求1、2、5
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10中任一项所述的氨基酸序列，并且还包含与SEQ ID NO:3639至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:3639的氨基酸序列。14.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3636
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3647中的任一者的氨基酸序列或与其至少95％同一的氨基酸序列。15.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含具有例如靶向肽的插入物的亲本氨基酸序列，其中所述插入物包含：(a)SEQ ID NO:1725
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3659中的任一者的氨基酸序列；或(b)来自SEQ ID NO:1725
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3622或3648
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3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。16.如权利要求15所述的AAV衣壳变体，其中：(i)所述亲本序列包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；(ii)所述亲本序列包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列；(iii)所述亲本序列包含在位置K449处的取代，例如K449R取代；(iv)所述亲本序列包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和/或
(v)编码亲本序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。17.如权利要求15或16所述的AAV衣壳变体，其中所述插入物包含选自以下的氨基酸序列：PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)、GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)、IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)、RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)，任选地，其中所述插入物在所述亲本氨基酸序列中紧随位置586、588或589之后插入。18.如权利要求15
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17中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)亲本序列的位置587处除“A”以外的氨基酸和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸；或(ii)所述亲本氨基酸序列的位置587处的缺失和/或位置588处的缺失。19.如权利要求15
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18中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：(i)紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入的包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的插入物，和所述亲本氨基酸序列的位置587
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588处的氨基酸“AQ”的缺失；(ii)紧随所述亲本氨基酸序列的位置588之后插入的包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列的插入物；(iii)包含选自以下的氨基酸序列的插入物：RDSPKGW(SEQ IDNO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)，所述插入物紧随所述亲本氨基酸序列的位置589之后插入。20.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体相对于包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对CNS细胞或组织(例如脑细胞、脑组织、脊髓细胞或脊髓组织)和/或肌肉细胞或组织的向性，任选地，其中：(i)所述脑细胞或组织为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体的细胞或组织；(ii)所述脊髓细胞或组织为颈部区域、胸部区域和/或腰部区域的细胞或组织；和/或(iii)所述肌肉细胞或组织为心脏肌肉(例如心房肌肉区或心室肌肉区)、四头肌和/或隔膜肌的细胞或组织。21.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中所述衣壳变体：(i)例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，在脑中富集至少约5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300或400倍；(ii)转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT
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PCR或RT
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ddPCR分析的分析，例如如实施例5中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少5、10、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍；(iii)向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT
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PCR或RT
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ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体；
(iv)向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT
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PCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍，任选地，其中所述脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域；和/或(v)向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中例如当通过例如qRT
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PCR或RT
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ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，病毒基因组的所述水平增加至少5、10、20、30、40或50倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。22.如权利要求1
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2、5、6
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10、13
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17或19
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21中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体显示相对于在背根神经节(DRG)中转导来说优先在脑区中的转导。23.如权利要求1
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3、6
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11、14
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21中任一项所述的AAV衣壳变体，其中所述衣壳变体：(i)例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，在脑中富集至少约300或400倍；(ii)转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT
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PCR或RT
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ddPCR分析的分析，例如如实施例5中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍；(iii)向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT
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PCR或RT
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ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体；(iv)向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT
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PCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍，任选地，其中所述脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域；和/或(v)向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中例如当通过例如qRT
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PCR或RT
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ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：