用于生产AAV颗粒的方法和系统技术方案

本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒，包含重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法和系统。在某些实施方案中，生产工艺和系统使用Sf9昆虫细胞作为病毒生产细胞。在某些实施方案中，生产工艺和系统在AAV颗粒生产中使用杆状病毒表达载体(BEV)和杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。(BIIC)。(BIIC)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产AAV颗粒的方法和系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求以下权益：2019年1月18日提交的名称为“用于生产AAV颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/794,199号；2019年1月18日提交的名称为“用于生产AAV颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/794,204号；2019年1月18日提交的名称为“用于生产AAV颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/794,208号；2019年1月18日提交的名称为“生产AAV颗粒的BIIC组合物”的美国临时专利申请第62/794,216号；2019年11月07日提交的名称为“用于生产AAV颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/931,848号；所述临时专利申请的内容各自通过引用整体并入本文。
[0003]序列表的引用
[0004]本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以创建于2020年1月17日的名称为20571526PCTSL.txt的文件形式提供，其大小为6,478,295个字节。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。


[0005]本公开描述了用于生产包含重组腺相关病毒(rAAV)的腺相关病毒(AAV)颗粒、组合物和制剂的方法和系统。在某些实施方案中，本公开提供了用于设计、生产、澄清、纯化、配制、过滤和处理rAAV和rAAV制剂的方法和系统。在某些实施方案中，生产工艺和系统使用草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)作为病毒生产细胞。在某些实施方案中，生产工艺和系统在rAAV生产中使用杆状病毒表达载体(BEV)和/或杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。

技术介绍

[0006]AAV已成为用于基因转移至哺乳动物细胞的最广泛研究和利用的病毒载体之一。参见例如Tratschin等人,Mol.Cell Biol.,5(11):3251
‑
3260(1985)和Grimm等人,Hum.Gene Ther.,10(15):2445
‑
2450(1999)，其内容各自通过引用整体并入本文，只要其不与本公开相冲突即可。腺相关病毒(AAV)载体是治疗性基因递送的有前景的候选物并且已在临床试验中被证实为安全且有效的。出于这个目的，改进AAV颗粒的设计和生产是热门研究领域。
[0007]仍需要用于生产AAV衣壳蛋白、AAV衣壳和相应AAV载体(例如AAV颗粒)的改进系统和方法。

技术实现思路

[0008]本公开提供了用于生产重组腺病毒相关病毒(rAAV)的方法和系统。
[0009]在某些实施方案中，用于生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法包括以下步骤中的一者或多者：(a)将至少一个病毒生产细胞(VPC)引入生物反应器中并且在所述生物反应器中扩增VPC数量至目标VPC细胞密度；(b)将至少一个包含AAV病毒表达构建体的表达杆状病毒
感染的昆虫细胞(BIIC)和至少一个包含AAV有效负载构建体的有效负载BIIC引入所述生物反应器中；(c)在使得在一个或多个所述VPC内生产一个或多个rAAV的条件下，在所述生物反应器中温育VPC、表达BIIC和有效负载BIIC的混合物；(d)从所述生物反应器收获病毒生产池，其中所述病毒生产池包含液体培养基和含有所述一个或多个rAAV的所述一个或多个VPC；(e)在化学溶胞条件下使用化学溶胞溶液使所述病毒生产池内的所述一个或多个VPC暴露于化学性溶胞，其中所述化学性溶胞将来自所述VPC的所述一个或多个rAAV释放到所述病毒生产池的液体培养基中；(f)经由一个或多个澄清过滤步骤处理病毒生产池，其中所述病毒生产池经由一个或多个澄清过滤系统处理；(g)经由一个或多个亲和色谱步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池经由一个或多个亲和色谱系统处理；(h)经由一个或多个离子交换色谱步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池经由一个或多个离子交换色谱系统处理；(i)经由一个或多个切向流过滤(TFF)步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池经由一个或多个切向流过滤(TFF)系统处理；以及(h)经由一个或多个病毒截留性过滤(VRF)步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池经由一个或多个病毒截留性过滤(VRF)系统处理。
[0010]在某些实施方案中，在生物反应器内的病毒生产细胞(VPC)中生产rAAV。在某些实施方案中，生物反应器的体积为至少5L、10L、20L、50L、100L或200L。在某些实施方案中，VPC包含昆虫细胞。在某些实施方案中，VPC包含Sf9昆虫细胞。在某些实施方案中，使用杆状病毒生产系统生产rAAV。
[0011]在某些实施方案中，BIIC引入时所述目标VPC细胞密度为2.0
‑
4.0
×
106个细胞/毫升、2.5
‑
3.5
×
106个细胞/毫升或约3.0
×
106个细胞/毫升。在某些实施方案中，BIIC引入时VPC细胞相对于引入所述生物反应器中的表达BIIC数目的比率在1:2.0
×
105‑
1:4.0
×
105v/v之间、在1:2.5
×
105‑
1:3.5
×
105v/v之间，约1:2.5
×
105v/v、约1:3.0
×
105v/v、约1:3.5
×
105v/v或约1:4.0
×
105v/v。在某些实施方案中，BIIC引入时VPC细胞相对于引入所述生物反应器中的有效负载BIIC数目的比率在1:5.0
×
104‑
2.0
×
105v/v之间、在1:8.0
×
104‑
1:1.5
×
105v/v之间，约1:8.0
×
104v/v、约1:1.0
×
105v/v或约1:1.5
×
105v/v。在某些实施方案中，引入所述生物反应器中的表达BIIC相对于引入所述生物反应器中的有效负载BIIC的比率在1:1
‑
5:1之间、在2:1
‑
4:1之间、在2.5:1
‑
3.5:1之间或为约3:1。
[0012]在某些实施方案中，所述方法包括一个或多个化学溶胞步骤，其中使病毒生产池暴露于化学性溶胞。在某些实施方案中，所述方法包括：从所述生物反应器收获所述病毒生产池，其中所述病毒生产池包含液体培养基和含有所述一个或多个rAAV的所述一个或多个VPC；以及在化学溶胞条件下使用化学溶胞溶液使所述病毒生产池内的所述一个或多个VPC暴露于化学性溶胞，其中所述化学性溶胞将来自所述VPC的所述一个或多个rAAV释放到所述病毒生产池的液体培养基中。在某些实施方案中，化学溶胞溶液包含选自精氨酸和其盐的稳定化添加剂。
[0013]在某些实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法，所述方法包括：(a)将至少一个病毒生产细胞(VPC)引入生物反应器中并且在所述生物反应器中扩增VPC数量至目标VPC细胞密度；(b)将至少一个包含AAV病毒表达构建体的表达杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)和至少一个包含AAV有效负载构建体的有效负载BIIC引入所述生物反应器中；(c)在导致在一个或多个所述VPC内生产一个或多个rAAV的条件下，在所述生物反应器中温育VPC、表达BIIC和有效负载BIIC的混合物；(d)从所述生物反应器收获病毒生产池，其中所述病毒生产池包含液体培养基和含有所述一个或多个rAAV的所述一个或多个VPC；(e)在化学溶胞条件下使用化学溶胞溶液使所述病毒生产池内的所述一个或多个VPC暴露于化学性溶胞，其中所述化学性溶胞将来自所述VPC的所述一个或多个rAAV释放到所述病毒生产池的所述液体培养基中；(f)通过一个或多个澄清过滤步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个澄清过滤系统处理；(g)通过一个或多个亲和色谱步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个亲和色谱系统处理；(h)通过一个或多个离子交换色谱步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个离子交换色谱系统处理；(i)通过一个或多个切向流过滤(TFF)步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个切向流过滤(TFF)系统处理；以及(j)通过一个或多个病毒截留性过滤(VRF)步骤处理所述病毒生产池，其中所述病毒生产池通过一个或多个病毒截留性过滤(VRF)系统处理。2.如权利要求1所述的方法，其中所述VPC包含Sf9昆虫细胞，并且其中使用杆状病毒生产系统生产所述rAAV。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的方法，其中所述生物反应器的体积为至少5L、10L、20L、50L、100L或200L。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中在BIIC引入时，所述目标VPC细胞密度为2.0
‑
4.0
×
106个细胞/毫升、2.5
‑
3.5
×
106个细胞/毫升、或约3.0
×
106个细胞/毫升。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中BIIC引入时的VPC细胞相对于引入所述生物反应器中的表达BIIC数目的比率为1:2.0
×
105至1:4.0
×
105v/v之间、1:2.5
×
105至1:3.5
×
105v/v之间、约1:2.5
×
105v/v、约1:3.0
×
105v/v、约1:3.5
×
105v/v或约1:4.0
×
105v/v。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中BIIC引入时的VPC细胞相对于引入所述生物反应器中的有效负载BIIC数目的比率为1:5.0
×
104至2.0
×
105v/v之间、1:8.0
×
104至1:1.5
×
105v/v之间、约1:8.0
×
104v/v、约1:1.0
×
105v/v或约1:1.5
×
105v/v。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中引入所述生物反应器中的表达BIIC相对于引入所述生物反应器中的有效负载BIIC的比率为1:1至5:1之间、2:1至4:1之间、2.5:1至3.5:1之间、或约3:1。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个澄清过滤步骤包括通过
深层过滤系统、0.2μm微滤系统或其组合处理所述病毒生产池。9.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述一个或多个澄清过滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：