本发明专利技术涉及治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法，具体而言，本发明专利技术涉及针对SOD1基因的小干扰RNA(siRNA)分子、编码siRNA分子的腺伴随病毒(AAV)载体和使用所述siRNA分子和AAV载体治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法。和AAV载体治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法。和AAV载体治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法。
【技术实现步骤摘要】
治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法
[0001]本申请是申请号为201580072992.1，申请日为2015年11月13日，专利技术名称为“治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2014年11月14日提交的标题为Treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS)with siRNAs targeting SOD
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1的美国临时专利申请号62/079,588、2015年8月31日提交的标题为Compositions and Methods of Treating Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS)的美国临时专利申请号62/211,992、2015年9月29日提交的标题为Compositions and Methods of Treating Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS)的美国临时专利申请号62/234,466的权益；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
[0004]对序列表的参考
[0005]本申请与电子形式的序列表一起提交。所述序列表作为2015年11月12日创建的标题为1011PCTSL.txt的文件提供，其大小为126,873字节。电子形式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
[0006]本专利技术涉及调节性多核苷酸，例如靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的小干扰RNA(siRNA)分子，的组合物、方法和设计、制备、生产、使用的方法和/或制剂。本文中使用的“调节性多核苷酸”是起作用以调节(增加或降低)靶基因的水平或量(例如，mRNA或蛋白水平)的任何核酸序列。SOD1基因的靶向可以干扰SOD1基因表达和SOD1酶生产。在某些实施方案中，将编码siRNA分子的核酸序列插入重组腺伴随病毒(AAV)载体中。还公开了使用siRNA分子抑制具有神经变性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS))的受试者中的SOD1基因表达的方法。
技术介绍
[0007]肌萎缩性侧索硬化(ALS)也被称作卢
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格里格病()Lou Gehrig
′
s disease)，是最致命的进行性神经变性疾病，其特征在于在初级运动皮质、脑干和脊髓中的运动神经元(MN)的显著损失。运动神经元的损失会破坏基础性的基本动作，诸如呼吸，并通常在诊断以后2～5年内造成患者的死亡。患者中运动功能的进行性衰退严重地破坏他们的呼吸能力，因而患者的存活需要某种形式的呼吸辅助。其它症状也包括手、臂、腿或吞咽肌的肌无力。有些患者(例如，FTD
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ALS)还可能发生额颞叶痴呆。
[0008]根据ALS协会，在美国每年诊断出大约5,600人患有ALS。ALS的发病率是每100,000人中2人，且据估测，多达30,000美国人在任何给定的时间可能患有该疾病。
[0009]已经描述了ALS的两种形式：一种是散发的ALS(sALS)，这是在美国最常见的ALS的形式，并占所有诊断的病例的90
‑
95％；另一种是家族性的ALS(fALS)，这发生在主要具有显性遗传的家族谱系中，且仅占美国所有病例的约5
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10％。sALS和fALS在临床上是不能辨别的。
[0010]病理学研究发现，一些细胞过程的紊乱发生在疾病发作以后，包括增加的ER应激、自由基(即，活性氧(ROS))的产生、线粒体功能障碍、蛋白聚集、细胞凋亡、炎症和谷氨酸盐兴奋性中毒，特别是在运动神经元(MN)中。
[0011]ALS的原因是复杂的和不同的。一般而言，认为ALS是一种复杂的遗传性障碍，其中与环境暴露组合的多个基因联合使得人成为易患的。已经发现了十多个与ALS有关的基因，包括SOD
‑
1(Cu
2+
/Zn
2+
超氧化物歧化酶)、TDP
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43(TARDBP、TAR DNA结合蛋白
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43)、FUS(在肉瘤中融合/在肉瘤中转移)、ANG(血管生成素)、ATXN2(共济失调蛋白2(Ataxin
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2))、含有缬酪肽的蛋白(VCP)、OPTN(视神经病变诱导基因(Optineurin))和染色体9开放读码框72(C9ORF72)中的非编码GGGGCC六核苷酸重复序列的扩增。但是，运动神经元变性的确切机制仍然是难以捉摸的。
[0012]目前，不存在ALS的治愈性治疗。唯一的FDA批准的药物是利鲁唑，其拮抗谷氨酸盐应答以减少ALS的病理学发展。但是，已经报道了处于早期阶段的ALS患者的仅约3个月的寿命延长，尚未观察到对于处于晚期阶段的ALS患者而言的治疗益处，这表明了患者的治疗选择的缺乏(Bensimon G等人,J Neurol.2002,249,609
‑
615)。因此，仍然需要可以有效地阻止疾病进展的新治疗策略。
[0013]正在针对散发性和家族性ALS的潜在治疗研究许多不同的策略。一个策略是基于可以促进神经元存活的神经营养因子(诸如胰岛素
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样生长因子I(IGF
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I)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Colivelin和活性依赖性的神经营养因子(ADNF)衍生的肽)的神经保护和/或再生作用。几个研究证实，神经营养因子在SOD1转基因小鼠中可以维持运动神经元功能性，因此改善运动表现。但是，这样的治疗经常不能延长SOD1小鼠的存活，从而提示，神经营养因子不足以延长神经元存活(参见Yacila和Sari,Curr Med Chem.,2014,21(31),3583
‑
3593的综述)。
[0014]ALS治疗的另一个策略已经聚焦于基于干细胞的疗法。干细胞具有产生运动神经元的潜力，由此替代ALS受影响的CNS(诸如初级运动皮质、脑干和脊髓)中的退化运动神经元。已经研究了从多种来源衍生出的干细胞，包括诱导的多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)(例如骨髓间充质干细胞(BMSC)和脂肪细胞干细胞(ASC))和神经组织起源神经干细胞(例如，胎儿脊神经干细胞(NSC)、多能神经祖细胞(NPC))(例如，Kim C等人,Exp.Neurobiol.,2014,23(3),207
‑
214的综述)。
[0015]超氧化物歧化酶I型(SOD1；Cu
2+
/Zn
2+
超氧化物歧化酶I型)基因中的突变是fALS的最常见原因，占所有fALS病例的约20
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30％。最近的报告表明，SOD1突变也可能与所有sALS病例中的约4％有关(Robberecht和Philip,Nat.Rev.Neurosci.,2013,14,248
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264)。SOD本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种腺伴随病毒(AAV)载体基因组，其包含用于抑制或遏制细胞中的SOD1表达的、位于2个反向末端重复序列(ITR)之间的核酸序列，其中所述核酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列包含与在表3、表11或表14中列出的序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，且所述反义链序列包含与在表3、表11或表14中列出的序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，且其中所述有义链序列和反义链序列共享至少4个核苷酸长度的互补性区域。2.一种腺伴随病毒(AAV)载体基因组，其包含用于抑制SOD1表达的、位于2个反向末端重复序列(ITR)之间的核酸序列，其中所述核酸序列编码siRNA双链体的有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列长20
‑
22个核苷酸并包含SEQ ID NO:51或385的18个核苷酸，且所述反义链序列长21
‑
22个核苷酸并包含SEQ ID NO:220或386的19个核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的AAV载体基因组，其中所述有义链序列包含SEQ ID NO:51的18个核苷酸且所述反义链序列包含SEQ ID NO:220的19个核苷酸。4.根据权利要求1或2所述的AAV载体基因组，其中所述有义链序列包含SEQ ID NO:385的20个核苷酸且所述反义链序列包含SEQ ID NO:386的20个核苷酸。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的AAV载体基因组，其中所述有义链序列和反义链序列包含互补性区域，其中所述互补性区域的长度介于17
‑
20个核苷酸。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的AAV载体基因组，其中所述有义链序列和反义链序列的长度独立地为21个核苷酸。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的AAV载体基因组，其中所述有义链序列和所述反义链序列中的至少一个包含至少1个或2个核苷酸的3
’
突出端。8.根据权利要求1
‑
7任一项所述的AAV载体基因组，其进一步编码包含所述有义链序列和反义链序列的调节性多核苷酸序列，其中所述调节性多核苷酸序列包含：i)5
’
侧接区域；ii)环区域；和/或iii)3
’
侧接区域。9.根据权利要求1
‑
8任一项所述的AAV载体基因组，其进一步包含：i)启动子；ii)增强子；iii)内含子；和/或iv)polyA序列。10.一种腺伴随病毒(AAV)颗粒，其包含权利要求1
‑
9任一项所述的AAV载体基因组和AAV衣壳蛋白。11.根据权利要求10所...
【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：
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