在杆状病毒/Sf9系统中大规模生产rAAV的表达载体技术方案

本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒(包括重组腺相关病毒(rAAV)颗粒)的方法和系统。在某些实施方案中，生产方法和系统在AAV颗粒的生产中使用杆状病毒表达载体(BEV)。在某些实施方案中，生产方法和系统使用草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)作为病毒生产细胞。在某些实施方案中，生产方法和系统使用缺少v‑cath基因的一部分或全部或者包括v‑cath基因的突变失活形式的BEV。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在杆状病毒/Sf9系统中大规模生产rAAV的表达载体相关申请的交叉引用本申请要求享有以下的权益：2018年10月15日提交的标题为在杆状病毒/Sf9系统中大规模生产rAAV的表达载体(EXPRESSIONVECTORSFORLARGE-SCALEPRODUCTIONOFrAAVINTHEBACULOVIRUS/Sf9SYSTEM)的美国临时专利申请号62/745,703；其内容通过引用整体并入本文。参考序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为20571514PCTSL.txt的文件形式提供，该文件创建于2019年10月15日，大小为25,091字节。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。专利
本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒(包括重组腺相关病毒(rAAV)颗粒)的方法和系统。在某些实施方案中，生产方法和系统在AAV颗粒的生产中使用杆状病毒表达载体(BEV)。在某些实施方案中，生产方法和系统使用草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)作为病毒生产细胞。在某些实施方案中，生产方法和系统使用缺少v-cath基因或包含v-cath基因的突变失活形式的BEV。背景AAV已经成为将基因转移到哺乳动物细胞中最广泛研究和利用的病毒载体之一。参见，例如，Tratschin等人,Mol.CellBiol.,5(11):3251-3260(1985)和Grimm等人,Hum.GeneTher.,10(15):2445-2450(1999)，其内容通过引用整体并入本文。腺相关病毒(AAV)载体是治疗性基因递送的有希望的候选者，并且在临床试验中已被证明是安全有效的。为此目的设计和生产改进的AAV颗粒是一个活跃的研究领域。随着AAV领域的发展，仍然需要用于生产AAV载体(例如AAV颗粒)和相应的基因疗法生产材料如杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的改进的系统和方法。专利技术概述本公开提出了用于生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的工程化核酸构建体。本公开描述了用于生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的病毒生产系统和病毒生产细胞(例如昆虫细胞)，其包括工程化核酸构建体。本公开描述了生产本公开的病毒生产细胞的方法，以及使用本公开的工程化核酸构建体、病毒生产系统和病毒生产细胞来生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法。本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)载体(例如重组腺相关病毒(rAAV)载体)的核酸构建体。在某些实施方案中，核酸构建体是AAV表达构建体。本公开描述了生产本公开的病毒生产细胞的方法。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：提供本公开的一种或多种表达构建体；提供本公开的有效载荷构建体；将一种或多种表达构建体和有效载荷构建体转染到病毒生产细胞中。在某些实施方案，病毒生产细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，病毒生产细胞是昆虫细胞。在某些实施方案中，病毒生产细胞是AAV病毒生产细胞。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：提供本公开的一种或多种AAV表达构建体；提供本公开的AAV有效载荷构建体；和将一种或多种AAV表达构建体和AAV有效载荷构建体转染到AAV病毒生产细胞中。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：提供本公开的病毒生产系统；和将病毒生产系统转染到病毒生产细胞中。本公开提出了用于改进AAV颗粒生产的方法和策略。这样的方法包括使用一种或多种重组杆状病毒表达载体(BEV)在昆虫细胞系中生产AAV颗粒的方法。在某些实施方案中，BEV缺少v-cath基因的一部分或全部，或包括v-cath基因的突变失活形式。在某些实施方案中，BEV缺少v-cath基因的一部分或全部。在某些实施方案中，BEV包括v-cath基因的突变失活形式。本公开提出了用于改进AAV颗粒生产的方法和策略，其导致AAV生产蛋白，特别是AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的更高产量和更少的蛋白质降解。在某些实施方案中，本公开的方法可以用于采用病毒生产细胞的生产系统，所述病毒生产细胞包括昆虫细胞，包括(但不限于)Sf9、Sf21和HighFiveTMBTI-TN-5B1-4细胞系。在某些实施方案中，本公开的方法可用于采用重组BEV系统，例如BacMagicTM(Millipore)、FlashBACTM(OxfordExpressionTechnologies)和BestBac2.0TM(ExpressionSystems)的生产系统中。在某些实施方案中，本公开提出了腺相关病毒(AAV)表达构建体，其包括VP编码区，该VP编码区包含编码选自VP1、VP2和VP3的一种或多种AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，AAV表达构建体是杆状病毒表达载体(BEV)。在某些实施方案中，BEV不包括功能性杆状病毒v-cath基因。在某些实施方案中，BEV缺少杆状病毒v-cath基因的一部分或全部。在某些实施方案中，BEV包含杆状病毒v-cath基因的突变失活形式。在某些实施方案中，一种或多种AAV衣壳蛋白的血清型选自VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含VP编码区的腺相关病毒(AAV)表达构建体，其包含编码选自VP1、VP2和VP3的一种或多种AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181015 US 62/745,7031.一种包含VP编码区的腺相关病毒(AAV)表达构建体，其包含编码选自VP1、VP2和VP3的一种或多种AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的AAV表达构建体，其中所述AAV表达构建体是杆状病毒表达载体(BEV)。


3.根据权利要求2所述的AAV表达构建体，其中所述BEV不包含功能性杆状病毒v-cath基因。


4.根据权利要求3所述的AAV表达构建体，其中所述BEV缺少部分或全部的杆状病毒v-cath基因。


5.根据权利要求3所述的AAV表达构建体，其中所述BEV包含杆状病毒v-cath基因的突变失活形式。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述一种或多种AAV衣壳蛋白的血清型选自VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA58...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·斯莱克，L·马兰加，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US