编码AAV生产蛋白的工程化核酸构建体制造技术

本公开描述了用于生产包括重组腺相关病毒(rAAV)颗粒在内的腺相关病毒(AAV)颗粒的方法和系统。在某些实施方案中，生产方法和系统使用草地贪夜蛾昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)作为病毒生产细胞。在某些实施方案中，生产方法和系统在AAV颗粒的生产中使用杆状病毒表达载体(BEV)。在某些实施方案中，生产方法和系统使用工程化核酸构建体，其编码AAV衣壳蛋白，例如VP1、VP2和VP3。在某些实施方案中，生产方法和系统使用工程化核酸构建体，其编码AAV复制蛋白，例如Rep78和Rep52。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码AAV生产蛋白的工程化核酸构建体相关申请的交叉引用本申请要求享有以下的权益：2018年10月5日提交的标题为NUCLEICACIDCONSTRUCTSENCODINGAAVCAPSIDPROTEINS(编码AAV衣壳蛋白的核酸构建体)的美国临时专利申请号62/741,764；2018年10月5日提交的标题为NUCLEICACIDCONSTRUCTSENCODINGAAVREPLICATIONPROTEINS(编码AAV复制蛋白的核酸构建体)的美国临时专利申请号62/741,855；2019年8月26日提交的标题为ENGINEEREDNUCLEICACIDCONSTRUCTSENCODINGAAVPRODUCTIONPROTEINS(编码AAV生产蛋白的工程化核酸构建体)的美国临时专利申请号62/891,670；其各自的内容均通过引用整体并入本文。参考序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为20571512PCTSL.txt的文件形式提供，该文件创建于2019年10月4日，大小为19,023字节。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。专利
本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒(包括重组腺相关病毒(rAAV)颗粒)的方法和系统。在某些实施方案中，生产方法和系统使用草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)作为病毒生产细胞。在某些实施方案中，生产方法和系统在AAV颗粒的生产中使用杆状病毒表达载体(BEV)。在某些实施方案中，生产方法和系统使用工程化核酸构建体，其编码AAV衣壳蛋白，例如VP1、VP2和VP3。在某些实施方案中，生产方法和系统使用工程化核酸构建体，其编码AAV复制蛋白，例如Rep78和Rep52。
技术介绍
AAV已经成为最广泛研究和利用的用于将基因转移到哺乳动物细胞的病毒载体之一。参见例如Tratschin等人,Mol.CellBiol.,5(11):3251-3260(1985)和Grimm等人,Hum.GeneTher.,10(15):2445-2450(1999)，其内容通过引用整体并入本文。腺相关病毒(AAV)载体是治疗性基因递送的有希望的候选物，并且在临床试验中已被证明安全有效。为此目的，改进的AAV颗粒的设计和生产是一个活跃的研究领域。随着AAV领域的发展的到来，仍然需要用于生产AAV载体(例如AAV颗粒)和相应基因治疗生产材料(例如杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC))的改进的系统和方法。
技术实现思路
本公开提出了工程化核酸构建体，其用于在重组腺相关病毒(rAAV)载体的生产过程中控制VP衣壳蛋白的量和/或比例。本公开描述了用于生产包含工程化核酸构建体的重组腺相关病毒(rAAV)载体的病毒生产系统和病毒生产细胞(例如昆虫细胞)。本公开描述了生产本公开的病毒生产细胞的方法，以及使用本公开的工程化核酸构建体、病毒生产系统和病毒生产细胞来生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法。本公开描述了核酸构建体，其用于生产腺相关病毒(AAV)载体，例如重组腺相关病毒(rAAV)载体。在某些实施方案中，核酸构建体是AAV表达构建体。在某些实施方案中，核酸构建体包含第一VP编码区，其含有编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码选自VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码仅VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包括编码VP2和VP3AAV衣壳蛋白但不编码VP1的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含第二VP编码区，其含有编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第二VP编码区包含编码VP1AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第二VP编码区包含编码仅VP1AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第二VP编码区包含编码VP1AAV衣壳蛋白但不编码VP2或VP3的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体是工程化核酸构建体。在某些实施方案中，核酸构建体包含第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列含有第一VP编码区和第二VP编码区。在某些实施方案中，第一核苷酸序列包含含有第一VP编码区的第一开放阅读框(ORF)和含有第二VP编码区的第二开放阅读框(ORF)。在某些实施方案中，核酸构建体包含含有第一VP编码区的第一核苷酸序列和含有第二VP编码区的第二核苷酸序列。在某些实施方案中，第一核苷酸序列包含含有第一VP编码区的第一开放阅读框(ORF)，并且第二核苷酸序列包含含有第二VP编码区的第二开放阅读框(ORF)。在某些实施方案中，第一开放阅读框不同于第二开放阅读框。在某些实施方案中，核酸构建体包含第一VP编码区，其含有编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；和第二VP编码区，其含有编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；并且第二VP编码区包含编码仅VP1AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；并且第二VP编码区包含编码VP1AAV衣壳蛋白但不编码VP2或VP3的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码仅VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；并且第二VP编码区包含编码仅VP1AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，第一VP编码区包含编码VP2和VP3AAV衣壳蛋白但不编码VP1的核苷酸序列；第二VP编码区包含编码VP1AAV衣壳蛋白但不编码VP2或VP3的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含一个或多个包含起始密码子的起始密码子区。在某些实施方案中，核酸构建体包含一个或多个包含终止密码子的终止密码子区。在某些实施方案中，核酸构建体包含一个或多个起始密码子区和一个或多个终止密码子区。在某些实施方案中，核酸构建体包含一个或多个表达控制区，其包括表达控制序列。在某些实施方案中，表达控制区包含一个或多个启动子序列。在某些实施方案中，表达控制区包含一种或多种选自以下的启动子序列：杆状病毒主要晚期启动子、昆虫病毒启动子、非昆虫病毒启动子、脊椎动物病毒启动子、核基因启动子、来自一个或多个物种的嵌合启动子(包括病毒和非病毒元件)、合成启动子，及其变体或衍生物。在某些实施方案中，表达控制区包括一个或多个选自以下的启动子序列：Ctx启动子、polh昆虫转录启动子、ΔIE-1昆虫转录启动子、p10昆虫特异性启动子、Δp10昆虫特异性启动子(p10的变体或衍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AAV表达构建体，其包含：第一VP编码区，其包含编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；和第二VP编码区，其包含编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181005 US 62/741,764;20181005 US 62/741,855;20191.一种AAV表达构建体，其包含：第一VP编码区，其包含编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列；和第二VP编码区，其包含编码选自VP1、VP2和VP3的一个或多个AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区包含编码VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区包含编码VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区包含编码仅VP2和VP3AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。


5.根据权利要求1所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区包含编码VP2和VP3AAV衣壳蛋白但不编码VP1的核苷酸序列。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第二VP编码区包含编码VP1的核苷酸序列。


7.根据权利要求1-5中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第二VP编码区包含编码仅VP1的核苷酸序列。


8.根据权利要求1-5中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第二VP编码区包含编码VP1但不编码VP2或VP3的核苷酸序列。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区和所述第二VP编码区编码AAV血清型的AAV衣壳蛋白。


10.根据权利要求9所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区的AAV血清型与所述第二VP编码区的AAV血清型相同。


11.根据权利要求9所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区的AAV血清型与所述第二VP编码区的AAV血清型不同。


12.根据权利要求9-11中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区和所述第二VP编码区的AAV血清型独立地选自：AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8RR533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAVSM10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAVSM10-1、AAVSM10-8、AAVSM100-3、AAVSM100-10、BNP61AAV、BNP62AAV、BNP63AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENNAAV10、日本AAV10血清型、AAVCBr-7.1、AAVCBr-7.10、AAVCBr-7.2、AAVCBr-7.3、AAVCBr-7.4、AAVCBr-7.5、AAVCBr-7.7、AAVCBr-7.8、AAVCBr-B7.3、AAVCBr-B7.4、AAVCBr-E1、AAVCBr-E2、AAVCBr-E3、AAVCBr-E4、AAVCBr-E5、AAVCBr-e5、AAVCBr-E6、AAVCBr-E7、AAVCBr-E8、AAVCHt-1、AAVCHt-2、AAVCHt-3、AAVCHt-6.1、AAVCHt-6.10、AAVCHt-6.5、AAVCHt-6.6、AAVCHt-6.7、AAVCHt-6.8、AAVCHt-P1、AAVCHt-P2、AAVCHt-P5、AAVCHt-P6、AAVCHt-P8、AAVCHt-P9、AAVCKd-1、AAVCKd-10、AAVCKd-2、AAVCKd-3、AAVCKd-4、AAVCKd-6、AAVCKd-7、AAVCKd-8、AAVCKd-B1、AAVCKd-B2、AAVCKd-B3、AAVCKd-B4、AAVCKd-B5、AAVCKd-B6、AAVCKd-B7、AAVCKd-B8、AAVCKd-H1、AAVCKd-H2、AAVCKd-H3、AAVCKd-H4、AAVCKd-H5、AAVCKd-H6、AAVCKd-N3、AAVCKd-N4、AAVCKd-N9、AAVCLg-F1、AAVCLg-F2、AAVCLg-F3、AAVCLg-F4、AAVCLg-F5、AAVCLg-F6、AAVCLg-F7、AAVCLg-F8、AAVCLv-1、AAVCLv1-1、AAVClv1-10、AAVCLv1-2、AAVCLv-12、AAVCLv1-3、AAVCLv-13、AAVCLv1-4、AAVClv1-7、AAVClv1-8、AAVClv1-9、AAVCLv-2、AAVCLv-3、AAVCLv-4、AAVCLv-6、AAVCLv-8、AAVCLv-D1、AAVCLv-D2、AAVCLv-D3、AAVCLv-D4、AAVCLv-D5、AAVCLv-D6、AAVCLv-D7、AAVCLv-D8、AAVCLv-E1、AAVCLv-K1、AAVCLv-K3、AAVCLv-K6、AAVCLv-L4、AAVCLv-L5、AAVCLv-L6、AAVCLv-M1、AAVCLv-M11、AAVCLv-M2、AAVCLv-M5、AAVCLv-M6、AAVCLv-M7、AAVCLv-M8、AAVCLv-M9、AAVCLv-R1、AAVCLv-R2、AAVCLv-R3、AAVCLv-R4、AAVCLv-R5、AAVCLv-R6、AAVCLv-R7、AAVCLv-R8、AAVCLv-R9、AAVCSp-1、AAVCSp-10、AAVCSp-11、AAVCSp-2、AAVCSp-3、AAVCSp-4、AAVCSp-6、AAVCSp-7、AAVCSp-8、AAVCSp-8.10、AAVCSp-8.2、AAVCSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAVCSp-8.6、AAVCSp-8.7、AAVCSp-8.8、AAVCSp-8.9、AAVCSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9，及其变体和嵌合体。


13.根据权利要求9-12中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一VP编码区是从参考核苷酸序列进行密码子优化的。


14.根据权利要求13所述的AAV表达构建体，其中针对昆虫细胞对第一VP编码区进行密码子优化。


15.根据权利要求13所述的AAV表达构建体，其中针对草地贪夜蛾细胞对第一VP编码区进行密码子优化。


16.根据权利要求13-15中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第一VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于100％。


17.根据权利要求13-15中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第一VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于95％。


18.根据权利要求13-15中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第一VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于90％。


19.根据权利要求13-15中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第一VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于85％。


20.根据权利要求13-15中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第一VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于80％。


21.根据权利要求9-20中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第二VP编码区是从参考核苷酸序列进行密码子优化的。


22.根据权利要求21所述的AAV表达构建体，其中针对昆虫细胞对第二VP编码区进行密码子优化。


23.根据权利要求21所述的AAV表达构建体，其中针对草地贪夜蛾细胞对第二VP编码区进行密码子优化。


24.根据权利要求21-23中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第二VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于100％。


25.根据权利要求21-23中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第二VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于95％。


26.根据权利要求21-23中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第二VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于90％。


27.根据权利要求21-23中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第二VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于85％。


28.根据权利要求21-23中任一项所述的AAV表达构建体，其中对所述第二VP编码区进行密码子优化以与所述参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于80％。


29.根据权利要求1-28中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述AAV表达构建体包含含有所述第一VP编码区的第一核苷酸序列，和含有所述第二VP编码区的第二核苷酸序列。


30.根据权利要求29所述的AAV表达构建体，其中所述第一核苷酸序列由包含所述第一VP编码区的第一开放阅读框(ORF)组成，并且所述第二核苷酸序列由包含所述第二VP编码区的第二开放阅读框(ORF)组成，其中所述第一开放阅读框与所述第二开放阅读框不同。


31.根据权利要求30所述的AAV表达构建体，其中所述第一开放阅读框编码VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白。


32.根据权利要求30所述的AAV表达构建体，其中所述第一开放阅读框编码VP2和VP3AAV衣壳蛋白，但不编码VP1AAV衣壳蛋白。


33.根据权利要求30-32中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第二开放阅读框编码VP1AAV衣壳蛋白，但不编码VP2或VP3AAV衣壳蛋白。


34.根据权利要求1-33中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述AAV表达构建体包含一个或多个含有起始密码子的起始密码子区，和一个或多个含有终止密码子的终止密码子区。


35.根据权利要求29-33中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一核苷酸序列包含含有第一起始密码子的第一起始密码子区和含有第一终止密码子的第一终止密码子区；并且其中所述第二核苷酸序列包含含有第二起始密码子的第二起始密码子区和含有第二终止密码子的第二终止密码子区。


36.根据权利要求30-33中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一开放阅读框包含含有第一起始密码子的第一起始密码子区和含有第一终止密码子的第一终止密码子区；并且其中所述第二开放阅读框包含含有第二起始密码子的第二起始密码子区和含有第二终止密码子的第二终止密码子区。


37.根据权利要求1-36中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述AAV表达构建体包含一个或多个表达控制区，所述一个或多个表达控制区包含一个或多个启动子序列。


38.根据权利要求29-36中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一核苷酸序列包含第一表达控制区，所述第一表达控制区包含第一启动子序列；并且其中所述第二核苷酸序列包含第二表达控制区，所述第二表达控制区包含第二启动子序列。


39.根据权利要求30-33和36中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一开放阅读框包含第一表达控制区，所述第一表达控制区包含第一启动子序列；并且其中所述第二开放阅读框包含第二表达控制区，所述第二表达控制区包含第二启动子序列。


40.根据权利要求37-39中任一项所述的AAV表达构建体，其中每个启动子序列独立地选自：杆状病毒主要晚期启动子、昆虫病毒启动子、非昆虫病毒启动子、脊椎动物病毒启动子、核基因启动子、来自一个或多个物种的包括病毒和非病毒元件的嵌合启动子、合成启动子，及其变体或衍生物。


41.根据权利要求37-39中任一项所述的AAV表达构建体，其中每个启动子序列独立地选自：polh昆虫转录启动子、ΔIE-1昆虫转录启动子、p10昆虫特异性启动子、Δp10昆虫特异性启动子、CMV哺乳动物转录启动子，及其变体或衍生物。


42.根据权利要求37-39中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一启动子序列是p10昆虫特异性启动子。


43.根据权利要求37-39中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第二启动子序列是Δp10昆虫特异性启动子。


44.根据权利要求37-39中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一启动子序列是p10昆虫特异性启动子；并且其中所述第二启动子序列是Δp10昆虫特异性启动子。


45.根据权利要求37-44中任一项所述的AAV表达构建体，其中优化一个或多个表达控制区以生产选自以下的VP1:VP2:VP3比例：大约或恰好1:1:10；大约或恰好2:2:10；大约或恰好3:3:10；大约或恰好4:4:10；大约或恰好5:5:10；大约或恰好1-2:1-2:10；大约或恰好1-3:1-3:10；大约或恰好1-4:1-4:10；大约或恰好1-5:1-5:10；大约或恰好2-3:2-3:10；大约或恰好2-4:2-4:10；大约或恰好2-5:2-5:10；大约或恰好3-4:3-4:10；大约或恰好3-5:3-5:10；和大约或恰好4-5:4-5:10。


46.根据权利要求29-33、35-36和38-45中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一核苷酸序列包含含有第一启动子序列的第一表达控制区、含有第一起始密码子的第一起始密码子区、第一VP编码区和含有第一终止密码子的第一终止密码子区；并且其中所述第二核苷酸序列包含含有第二启动子序列的第二表达控制区、含有第二起始密码子的第二起始密码子区、第二VP编码区和含有第二终止密码子的第二终止密码子区。


47.根据权利要求30-33、36和39-45中任一项所述的AAV表达构建体，其中所述第一开放阅读框包含含有第一启动子序列的第一表达控制区、含有第一起始密码子的第一起始密码子区、第一VP编码区和含有第一终止密码子的第一终止密码子区；并且其中所述第二开放阅读框包含含有第二启动子序列的第二表达控制区、含有第二起始密码子的第二起始密码子区、第二VP编码区和含有第二终止密码子的第二终止密码子区。


48.一种AAV病毒生产系统，其包括AAV表达构建体和包含AAV有效载荷的AAV有效载荷构建体。


49.根据权利要求48所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV表达构建体为根据权利要求1-47中任一项所述的AAV表达构建体。


50.根据权利要求48-49中任一项所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV病毒生产系统包含AAV病毒生产细胞。


51.根据权利要求50所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV病毒生产细胞包含所述AAV表达构建体和所述AAV有效载荷构建体。


52.根据权利要求50-51中任一项所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV病毒生产细胞是哺乳动物细胞。


53.根据权利要求50-51中任一项所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV病毒生产细胞是HEK293细胞。


54.根据权利要求50-51中任一项所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV病毒生产细胞是昆虫细胞。


55.根据权利要求50-51中任一项所述的AAV病毒生产系统，其中所述AAV病毒生产细胞是Sf9细胞或Sf21细胞。


56.一种生产AAV病毒生产细胞的方法，该方法包括：提供包括AAV表达构建体和AAV有效载荷构建体的AAV病毒生产系统；将AAV病毒生产系统转染到AAV病毒生产细胞中。


57.根据权利要求56所述的方法，其中所述AAV表达构建体为根据权利要求1-47中任一项所述的AAV表达构建体。


58.根据权利要求56所述的方法，其中所述AAV病毒生产系统为根据权利要求48-49中任一项所述的AAV病毒生产系统。


59.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是哺乳动物细胞。


60.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是HEK293细胞。


61.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是昆虫细胞。


62.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是Sf9细胞或Sf21细胞。


63.一种在AAV病毒生产细胞中表达VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白的方法，该方法包括：提供包含AAV表达构建体的AAV病毒生产系统，所述AAV表达构建体包含一个或多个VP编码区；将AAV病毒生产系统转染到AAV病毒生产细胞中；并使AAV病毒生产细胞暴露于允许AAV病毒生产细胞将VP编码区加工成相应的VP1、VP2和VP3AAV衣壳蛋白的条件。


64.根据权利要求63所述的方法，其中所述AAV表达构建体为根据权利要求1-47中任一项所述的AAV表达构建体。


65.根据权利要求63所述的方法，其中所述AAV病毒生产系统为根据权利要求48-49中任一项所述的AAV病毒生产系统。


66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是哺乳动物细胞。


67.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是HEK293细胞。


68.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是昆虫细胞。


69.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是Sf9细胞或Sf21细胞。


70.一种在AAV病毒生产细胞中生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，所述方法包括：提供包含AAV表达构建体和AAV有效载荷构建体的AAV病毒生产系统，其中AAV表达构建体包含一个或多个VP编码区，所述VP编码区包含一个或多个编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，并且其中AAV有效载荷构建体包含含有AAV有效载荷的有效载荷区；将AAV病毒生产系统转染到AAV病毒生产细胞中；使AAV病毒生产细胞暴露于允许AAV病毒生产细胞将AAV表达构建体和AAV有效载荷构建体加工成rAAV颗粒的条件；并从AAV病毒生产细胞收集rAAV颗粒。


71.根据权利要求70所述的方法，其中所述AAV表达构建体为根据权利要求1-47中任一项所述的AAV表达构建体。


72.根据权利要求64所述的方法，其中所述AAV病毒生产系统为根据权利要求48-49中任一项所述的AAV病毒生产系统。


73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是哺乳动物细胞。


74.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是HEK293细胞。


75.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是昆虫细胞。


76.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒生产细胞是Sf9细胞或Sf21细胞。


77.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·斯莱克，L·马兰加，S·切基尼，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US