经修饰的病毒衣壳制造技术

本发明专利技术涉及用于鉴定当在衣壳上展示时赋予包含此类衣壳的病毒颗粒以所需性质，例如衍生自HSV pUL22蛋白的多肽的方法，以及用于设计和制造具有改进的性质的病毒载体和病毒颗粒的方法。鉴定方法基于衣壳文库，其中衣壳变体不形成病毒基因组的含有条形码的一部分，并且其中与衣壳变体相关的条形码通过测序确定，之后使用病毒载体。因此，生物样品中的衣壳变体普遍存在可通过单独对条形码进行测序来确定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的病毒衣壳
本专利技术涉及病毒载体和颗粒以及用于设计和制造所述病毒载体和颗粒的方法和工具。
技术介绍
通过定向进化对病毒载体进行工程改造产生了大量具有改进的向性和功能的有效衣壳1-9。尽管最近添加Cre-重组酶限制型选择和深度测序用于优化在近年来提高了这种方法的准确性和效力，但其仍然受到生产过程中产生的系列感染性和嵌合体的限制，所述生产需要多代筛选直至真正的功能性衣壳表面2-4。由于所述方法的随机性，从头序列的非常小的一部分编码有效的框内氨基酸取代，并且甚至更少者正确组装。这种筛选方法本身也无法重现，并且必须事后进行优化。所产生的衣壳变体也几乎不了解功能以及参与的分子靶标。常用的替代方法是合理设计，其中基于衣壳的已知性质(例如，从AAV2衣壳中除去硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合)或通过衣壳表面的系统性氨基酸取代或高亲和力纳米抗体的展示进行系统性改变10-14。尽管在功能上更加严格，但这种方法提供较小多样性且具有更受限制的功能潜力。因此，需要用于设计具有改进的性质的衣壳的方法，所述衣壳是可靠的、可再现的并且允许较大多样性。
技术实现思路
本文提供的方法克服了上述缺点。通过对已知具有或疑似具有所需性质的选定蛋白质应用合理的、系统的方法，可表达编码经修饰的病毒颗粒的经修饰的病毒载体文库，其中所述经修饰的病毒颗粒包含展示所述选定蛋白质的片段的经修饰的衣壳。使用定制的筛选，可鉴定对于赋予病毒颗粒所需的性质来说特别有用的所述蛋白质的片段。这些可用于设计经修饰的衣壳，即展示所述鉴定的片段之一的具有定制性质的衣壳。如可在实施例中看出，所述方法可例如用于设计对于给定细胞类型具有增加的向性和/或感染性的病毒颗粒。本专利技术的方法是可靠的、可再现的并且允许较大的多样性。所产生的衣壳可用于递送转基因并且不仅可用于治疗和基因疗法的方法中，而且还可用于例如蛋白质结构域的功能定位和药物筛选中。本文提供了一种制造病毒载体文库的方法，所述方法包括以下步骤：i)从具有或疑似具有所需性质的一组多肽中选择一个或多个候选多肽，并检索所述多肽的序列；ii)提供多种候选多核苷酸，每种候选多核苷酸编码所述候选多肽之一的多肽片段，以使得在转录和翻译后，每个候选多肽由每个候选多肽的一个或多个多肽片段表示；iii)提供多种条形码多核苷酸；iv)将每种候选多核苷酸与条形码多核苷酸一起插入包含衣壳基因和病毒基因组的病毒载体中，从而获得多个病毒载体，所述病毒载体各自包含与条形码多核苷酸可操作地连接的单一候选多核苷酸，其中所述候选多核苷酸被插入所述衣壳基因内，所述衣壳基因在所述病毒基因组之外，并且所述条形码多核苷酸被插入所述病毒基因组内；其中所述病毒载体包含编码可检测标记物的标记物多核苷酸；v)在扩增系统中扩增在步骤iv)中获得的多个病毒载体，其中每个病毒载体在所述扩增系统中以多个拷贝存在；以及a)在参考系统中从步骤v)的扩增系统中检索并转移所述多个病毒载体的至少第一部分，从而将每种条形码多核苷酸定位至一种候选多核苷酸；以及b)将所述多个病毒载体的第二部分保持在扩增系统中，并任选地在生产系统中转移所述第二部分的全部或部分以获得多个病毒颗粒。还提供了一种设计具有所需性质的病毒载体的方法，所述方法包括上述步骤i)至v)，并且还包括以下步骤：vi)从上述步骤v)b)的扩增系统中检索一部分病毒载体，或从上述步骤v)b)的生产系统中检索所述病毒颗粒的至少一部分，并使细胞群体与所述检索的病毒载体或病毒颗粒接触；vii)监测标记物表达并选择其中标记物表达遵循所需模式的细胞；viii)鉴定在步骤vii)中选择的细胞中表达的条形码多核苷酸，从而鉴定负责所需性质的候选多核苷酸和相应的候选多肽；ix)设计包含经修饰的衣壳基因的病毒载体，其中所述经修饰的衣壳基因包含步骤viii)中鉴定的候选多核苷酸中的一种。还提供了一种制造具有所需性质的病毒颗粒的方法，所述方法包括上述步骤i)至v)，并且还包括以下步骤：vi)从上述步骤v)b)的扩增系统中检索所述多个病毒载体的至少一部分，或从上述步骤v)b)的生产系统中检索所述多个病毒颗粒的至少一部分；vii)使细胞群体与步骤vi)中获得的检索的病毒载体或病毒颗粒接触；viii)监测标记物表达并选择其中标记物表达遵循所需模式的细胞；ix)鉴定在步骤viii)中鉴定的细胞中表达的条形码多核苷酸，从而鉴定负责所需性质的候选多核苷酸和相应的候选多肽；x)设计包含经修饰的衣壳基因的病毒载体，其中所述经修饰的衣壳基因包含步骤ix)中鉴定的候选多核苷酸中的一种；xi)在扩增系统中或在生产系统中产生步骤x)的病毒载体，从而获得具有所需性质的病毒颗粒。还提供了一种将转基因递送至靶细胞的方法，所述方法包括：a)提供包含经修饰的衣壳的经修饰的病毒载体或经修饰的病毒颗粒并包封转基因，其中所述经修饰的病毒载体或所述经修饰的病毒颗粒是上述步骤xi)中定义的病毒载体或病毒颗粒；以及b)将所述经修饰的病毒载体或所述经修饰的病毒颗粒注射到注射部位中。还提供了一种病毒载体文库，每个病毒载体包含：i)用于在宿主细胞中表达所述病毒载体的主链；ii)衣壳基因和插入其中的候选多核苷酸，所述候选多核苷酸编码候选多肽的多肽片段；iii)标记物多核苷酸；以及iv)条形码多核苷酸；其中所述候选多肽选自预定义的组，所述预定义的组包括一个或多个具有或疑似具有所需性质的多肽；其中在转录和翻译后，每个候选多肽由所述文库中的一个或多个多肽片段表示；将所述候选多核苷酸插入所述病毒载体的衣壳基因内，以使得其可转录并翻译成在所述衣壳上展示的多肽片段，并且可操作地连接至插入所述病毒基因组内的条形码多核苷酸，并且所述标记物多核苷酸包含在所述病毒基因组内，且所述衣壳基因在所述病毒基因组之外。还提供了包含本文所述的病毒载体文库的一种或多种细胞。还提供了一种编码用于将转基因递送至靶细胞的病毒颗粒的病毒载体，所述病毒载体包含经修饰的衣壳基因和待递送至所述靶细胞的转基因；其中所述经修饰的衣壳基因在所述病毒基因组之外，并且包含编码改进所述转基因的递送和/或靶向靶细胞的多肽的多核苷酸。还提供了由本文所述的病毒载体编码的病毒颗粒。还提供了一种用于将转基因递送至靶细胞的经修饰的病毒载体或病毒颗粒，所述经修饰的病毒载体或病毒颗粒包含经修饰的衣壳和待递送至所述靶细胞的转基因；其中所述经修饰的衣壳改进以下中的一项或多项：与包含天然衣壳基因和所述转基因的未修饰的病毒颗粒相比，所述转基因递送至所述靶细胞，靶向所述靶细胞，所述经修饰的病毒载体或经修饰的病毒颗粒的感染性和/或所述经修饰的病毒载体或经修饰的病毒颗粒的逆行转运。还提供了本文所述的病毒载体、病毒颗粒、经修饰的病毒载体或经修饰的病毒颗粒用于基因疗法的用途。还提供了本文所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造病毒载体文库的方法，所述方法包括：/ni)从具有或疑似具有所需性质的一组多肽中选择一个或多个候选多肽，并检索所述多肽的序列；/nii)提供多种候选多核苷酸，每种候选多核苷酸编码所述候选多肽之一的多肽片段，以使得在转录和翻译后，每个候选多肽由每个候选多肽的一个或多个多肽片段表示；/niii)提供多种条形码多核苷酸；/niv)将每种候选多核苷酸与条形码多核苷酸一起插入包含衣壳基因和病毒基因组的病毒载体中，从而获得多个病毒载体，所述病毒载体各自包含与条形码多核苷酸可操作地连接的单一候选多核苷酸，其中所述候选多核苷酸被插入所述衣壳基因内，所述衣壳基因在所述病毒基因组之外，并且所述条形码多核苷酸被插入所述病毒基因组内；其中所述病毒载体包含编码可检测标记物的标记物多核苷酸；/nv)在扩增系统中扩增在步骤iv)中获得的所述多个病毒载体，其中每个病毒载体在所述扩增系统中以多个拷贝存在；以及/na)在参考系统中从步骤v)的扩增系统中检索并转移所述多个病毒载体的至少第一部分，从而将每种条形码多核苷酸定位至一种候选多核苷酸；以及/nb)将所述多个病毒载体的第二部分保持在扩增系统中，并任选地在生产系统中转移所述第二部分的全部或部分以获得多个病毒颗粒。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180215 EP 18156932.81.一种制造病毒载体文库的方法，所述方法包括：
i)从具有或疑似具有所需性质的一组多肽中选择一个或多个候选多肽，并检索所述多肽的序列；
ii)提供多种候选多核苷酸，每种候选多核苷酸编码所述候选多肽之一的多肽片段，以使得在转录和翻译后，每个候选多肽由每个候选多肽的一个或多个多肽片段表示；
iii)提供多种条形码多核苷酸；
iv)将每种候选多核苷酸与条形码多核苷酸一起插入包含衣壳基因和病毒基因组的病毒载体中，从而获得多个病毒载体，所述病毒载体各自包含与条形码多核苷酸可操作地连接的单一候选多核苷酸，其中所述候选多核苷酸被插入所述衣壳基因内，所述衣壳基因在所述病毒基因组之外，并且所述条形码多核苷酸被插入所述病毒基因组内；其中所述病毒载体包含编码可检测标记物的标记物多核苷酸；
v)在扩增系统中扩增在步骤iv)中获得的所述多个病毒载体，其中每个病毒载体在所述扩增系统中以多个拷贝存在；以及
a)在参考系统中从步骤v)的扩增系统中检索并转移所述多个病毒载体的至少第一部分，从而将每种条形码多核苷酸定位至一种候选多核苷酸；以及
b)将所述多个病毒载体的第二部分保持在扩增系统中，并任选地在生产系统中转移所述第二部分的全部或部分以获得多个病毒颗粒。


2.一种设计具有所需性质的病毒载体的方法，所述方法包括如权利要求1所述的方法，并且还包括以下步骤：
vi)从权利要求1的步骤v)b)的扩增系统中检索一部分病毒载体，或从权利要求1的步骤v)b)的生产系统中检索所述病毒颗粒的至少一部分，并使细胞群体与所述检索的病毒载体或病毒颗粒接触；
vii)监测标记物表达并选择其中标记物表达遵循所需模式的细胞；
viii)鉴定在步骤vii)中选择的细胞中表达的条形码多核苷酸，从而鉴定负责所述所需性质的候选多核苷酸和相应的候选多肽；
ix)设计包含经修饰的衣壳基因的病毒载体，其中所述经修饰的衣壳基因包含步骤viii)中鉴定的所述候选多核苷酸中的一种。


3.一种制造具有所需性质的病毒载体的方法，所述方法包括如权利要求1所述的方法，并且还包括以下步骤：
vi)从步骤v)b)的扩增系统中检索所述多个病毒载体的至少一部分，或从步骤v)b)的生产系统中检索所述多个病毒颗粒的至少一部分；
vii)使细胞群体与步骤vi)中获得的检索的病毒载体或病毒颗粒接触；
viii)监测标记物表达并选择其中标记物表达遵循所需模式的细胞；
ix)鉴定在步骤viii)中鉴定的细胞中表达的条形码多核苷酸，从而鉴定负责所需性质的候选多核苷酸和相应的候选多肽；
x)设计包含经修饰的衣壳基因的病毒载体，其中所述经修饰的衣壳基因包含步骤ix)中鉴定的所述候选多核苷酸中的一种；
xi)在生产系统中产生步骤x)的病毒载体，从而获得具有所述所需性质的所述病毒载体或所述病毒颗粒。


4.一种将转基因递送至靶细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含经修饰的衣壳的经修饰的病毒载体或经修饰的病毒颗粒并包封转基因，其中所述经修饰的病毒载体或所述经修饰的病毒颗粒是权利要求3的步骤xi)中定义的病毒载体或病毒颗粒；以及
b)将所述经修饰的病毒载体或所述经修饰的病毒颗粒注射到注射部位中。


5.一种病毒载体文库，每个病毒载体包含：
i)用于在宿主细胞中表达所述病毒载体的主链；
ii)衣壳基因和插入其中的候选多核苷酸，所述候选多核苷酸编码候选多肽的多肽片段；
iii)标记物多核苷酸；以及
iv)条形码多核苷酸；
其中
所述候选多肽选自预定义的组，所述预定义的组包括一个或多个具有或疑似具有所需性质的多肽；
其中在转录和翻译后，每个候选多肽由所述文库中的一个或多个多肽片段表示；
将所述候选多核苷酸插入所述病毒载体的所述衣壳基因内，以使...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·比约尔克隆德，M·戴维森，
申请(专利权)人：T·比约尔克隆德，M·戴维森，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE