用于口服递送的改进的病毒样纳米颗粒制造技术

提供了基于戊型肝炎病毒(HEV)的病毒样纳米颗粒(HEVNP)，其由含有与金纳米簇缀合的开放阅读框2(ORF2)蛋白的至少一部分的修饰的衣壳蛋白制成。还提供了使用HEVNP靶向递送核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于口服递送的改进的病毒样纳米颗粒相关申请本申请要求2018年6月6日提交的美国临时专利申请第62/681,637号的优先权，所述美国临时专利申请的内容在此出于所有目的通过引用以其整体并入。美国政府对本申请权利的声明本申请的基础专利技术是在美国国立卫生研究院以及国家食品和农业研究所给予的第EB021230、CA198889和Ca-D*MCB-7399-H号基金的美国政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。专利技术背景病毒样颗粒(VLP)可以用作用于靶向递送诊断和治疗方案，如DNA/RNA和各种化学治疗剂的纳米载体。戊型肝炎病毒(HEV)是引起人类急性肝炎的肠传播病毒。HEV病毒样颗粒(HEVVLP)是衣壳蛋白二十面体笼，其可以通过在真核表达系统中表达主要衣壳蛋白HEV开放阅读框2(ORF2)而产生。HEVVLP在酸和蛋白水解环境中是稳定的，这是HEV的天然传播途径所需的特征。因此，HEVVLP代表可以用于例如递送治疗剂、显像剂或疫苗的有希望的纳米载体。利用HEV的通过口腔途径的天然感染，基于HEV的递送技术被设计用于通过口服施用的治疗用途。尽管HEVVLP相当稳定，但暴露于消化道中的极端pH和酶促活性仍会带来某些挑战。因此，迫切需要开发HEVVLP的新型修饰以在这些条件下实现改进的稳定性，并因此产生更可靠的基于HEV的递送系统。本专利技术满足了这种和其它相关的需要。专利技术概述本专利技术提供了新的和改进的HEV纳米颗粒(HEVNP)，其具有改进的稳定性(尤其是在较高的pH值下)的表面缀合的金纳米簇，因此特别适于通过口服施用递送由HEV-VLP携带的治疗方式。在第一方面，本专利技术提供了修饰的衣壳蛋白，其包含戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框2(ORF2)蛋白的一部分，在SEQIDNO：1所示的HEVORF2蛋白氨基酸序列的342-344、402-408、510-514、493-498、570-579、529-536或520-525区段或者SEQIDNO:2、3、4、5或6相应区段中的至少一个氨基酸被半胱氨酸替代，并且所述半胱氨酸继而与选自具有大于20的原子序数的第3族至第18族的元素的纳米簇缀合。在一些实施方案中，所述元素是金或银。在一些实施方案中，SEQIDNO:1中所示的HEVORF2蛋白氨基酸序列的氨基酸残基342或573(或342和573两者)或者SEQIDNO:2、3、4、5或6的相应残基被半胱氨酸替代。在一些实施方案中，所述半胱氨酸是化学衍生的，例如用6-碳间隔基pMBA44衍生的，并且通过接头，例如马来酰亚胺接头与金纳米簇缀合。在一些实施方案中，所述纳米簇与所述半胱氨酸水平距离离为约2-3nm，并且垂直距离为约2nm。在一些实施方案中，所述纳米簇的直径为约1.5-3nm。在第二方面，本专利技术提供了组合物，其包含(1)以上和本文所述的修饰的HEVORF2衣壳蛋白和(2)封装在由所述修饰的衣壳蛋白形成的HEV病毒样颗粒(VLP)中的生物活性剂(例如，异源多核苷酸，DNA或RNA，或者异源多肽，如胰岛素蛋白或者编码胰岛素的DNA或RNA)。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂，例如，特别适于旨在口服施用的制剂的一种或多种赋形剂。在第三方面，本专利技术提供了将生物活性剂(例如，异源多核苷酸，DNA或RNA，或者异源多肽，如胰岛素蛋白或者编码胰岛素的DNA或RNA)靶向递送至肝细胞的方法。所述方法包括使肝细胞与以上和本文所述的任何组合物接触的步骤。在一些实施方案中，肝细胞在患者体内，并且接触步骤包括将以上和本文所述的组合物施用至所述患者。在一些实施方案中，施用是口服施用。在一些实施方案中，修饰的衣壳蛋白用pMBA44衍生，并且通过马来酰亚胺接头与金纳米簇缀合。在一些实施方案中，生物活性剂是编码胰岛素、胰岛素原或前胰岛素原的多核苷酸序列。在其它实施方案中，生物活性剂是胰岛素多肽。在一些实施方案中，所述患者已被诊断患有可通过所述生物活性剂治疗的疾病或病况，例如糖尿病。附图简述图1：用AuNC表面功能化HEV-VLP。(A)HEVNP的衣壳蛋白组合物包括包含壳(s)、中间(m)和突出(p)结构域的二聚体亚基。用连接至M结构域的富含脯氨酸的铰链稳定P结构域，而S结构域稳定二十面体壳。P结构域用于表面功能化。此处，用半胱氨酸替代残基573(以黄色突出显示)以允许硫醇交换二硫键。二聚体形成通过5倍轴的局部分子间相互作用稳定的五聚体(因此是十聚体)，并通过3倍的Ca+桥组装成HEVNP的衣壳。(B)Au102-pMBA-C6-马来酰亚胺(AuNC)通过硫醇交换反应与573C缀合。(C)使用冷冻电子显微镜(Cryo-EM)表征AuNC并通过单颗粒分析处理3D重建的数据。无Au和Au缀合的比较以箭头所指的高强度区为特征。(D)用HEVNP作为对照和HEVNP+Au102C6产生的3D重建显示5倍轴周围的高强度区(E)，表明5倍轴周围的AuNC定位和稳定。图2：由于5倍界面处分子间相互作用减弱，HEVNP的稳定性在高pH下降低。(A)HEVNP在pH6.2和pH8.0下的TEM图像；在pH8.0下显示较大的颗粒。(B)圆形平均和1-D强度分布。观察到在pH8.0的HEVNP比不含AuNC的HEVNP大约10-15％。(C)进行分子建模，观察到随着pH增加至8，分子间相互作用在5倍时降低。图3：在AuNC-C6缀合后HEVNP的稳定性增强。(A)与AuNC-C6缀合的HEVNP的TEM图像揭示了HEVNP的总体尺寸不随pH增加而改变。(B)圆形平均和1-D强度分布。数据显示，由于pH增加，HEVNP大小没有变化。(D)2D强度切片横截面分析揭示了Cryo-EM重建的3D密度图的5倍处的高强度区。(E)模型，其显示了通过HEVNP的二十面体5倍轴周围AuNC-C6的共定位潜在地保留了关键分子间相互作用的机制。图4：显示HEVNP的3个不同结构域的HEVNP单体。壳结构域(S)(AA:118-317)在亚基间相互作用中是关键的，稳定二十面体衣壳。中间结构域(M)(AA:318-451)与S结构域结合并相互作用。突出结构域(P)(452-606)在2倍轴处形成二聚体尖峰(spike)。M结构域通过富含脯氨酸的铰链与P结构域连接，这促进突出尖峰的拓扑变化。图5：通过可延伸的间隔臂在位置#N573C处与HEVNP的AuNC缀合的建模。HEVNP的5倍二十面体轴周围AuNC的共定位。图6：在S结构域5倍处的径向线索，显示了在AuNC缀合中观察到的高密度区和在WT构建体中不存在这些高密度区。图7：显示5倍轴周围的电子致密区的实验数据和建模数据的比较。完全占用允许5倍周围的5个独特密度，部分占用将允许4个或更少的AuNC在5倍周围共定位。Cryo-EMSinglePatrice重建分析表明，AuNC在水平上(垂直于5倍轴)是柔性的(范围为2-3nm)，并且在垂直上约2nm。图8：5倍周围的AuNC共定位以保留TYR288和ASN200之间的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰的衣壳蛋白，其包含戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框2(ORF2)蛋白的一部分，其中在SEQ ID NO:1所示的HEV ORF2蛋白氨基酸序列的342-344、402-408、510-514、493-498、570-579、529-536或520-525区段或者SEQ ID NO:2、3、4、5或6的相应区段中的至少一个氨基酸被半胱氨酸替代，所述半胱氨酸与选自具有大于20的原子序数的第3族至第18族的元素的纳米簇缀合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180606 US 62/681,6371.修饰的衣壳蛋白，其包含戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框2(ORF2)蛋白的一部分，其中在SEQIDNO:1所示的HEVORF2蛋白氨基酸序列的342-344、402-408、510-514、493-498、570-579、529-536或520-525区段或者SEQIDNO:2、3、4、5或6的相应区段中的至少一个氨基酸被半胱氨酸替代，所述半胱氨酸与选自具有大于20的原子序数的第3族至第18族的元素的纳米簇缀合。


2.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述元素是金。


3.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中SEQIDNO:1所示的HEVORF2蛋白氨基酸序列的氨基酸残基342和/或573或者SEQIDNO:2、3、4、5或6的相应残基被半胱氨酸替代。


4.如权利要求2所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述半胱氨酸是化学衍生的并且通过接头与金纳米簇缀合。


5.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述纳米簇与所述半胱氨酸水平距离为约2-3nm，并且垂直距离为约2nm。


6.如权利要求1所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述纳米簇的直径为约1.5-3nm。


7.如权利要求2所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述半胱氨酸用6-碳间隔基衍生。


8.如权利要求7所述的修饰的衣壳蛋白，其中所述6-碳间隔基是pMBA44。

【专利技术属性】
技术研发人员：R·霍兰德·程，陈俊杰，穆罕默德·阿里·贝科格利，玛丽·斯塔克，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US