一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用。对PCV2DNA中的GAS样基序进行突变，使得突变的PCV2DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合，并通过病毒拯救获得复制能力远低于野生型PCV2毒株的突变毒株。该突变毒株可以用于研究PCV2复制机制和减毒活疫苗，从而为PCV2的防控提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用
本专利技术涉及猪圆环病毒2型(PCV2)突变毒株的构建，具体涉及GAS样基序突变的PCV2病毒。
技术介绍
PCV2感染造成机体产生免疫抑制，导致PCV2与其他病原体，例如，猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪细小病毒(PPV)等混合感染，还使感染猪对疫苗保护性降低，严重威胁着养猪业的发展。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是PCV2的复制机制并不明确。研究PCV2DNA复制机制成为目前研究PCV2复制机制关键环节之一。信号传导与转录激活因子5(STAT5)属于信号传导及转录激活蛋白家族，是一种能与DNA结合的蛋白质。研究表明，人的STAT5蛋白通过与人细小病毒B19DNAGAS样基序结合促进病毒DNA复制。但对于PCV2而言，宿主细胞蛋白STAT5是否与病毒的蛋白或DNA结合，并且其结合后对病毒复制带来怎样的影响并未得到研究。同时，目前尚难以通过基因工程手段有效获得复制能力明显减弱的PCV2突变毒株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用，该突变毒株的复制能力远低于野生型PCV2毒株。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种突变的PCV2病毒，该突变的PCV2病毒(DNA)在复制中不能与宿主细胞内的STAT5蛋白结合，即所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内。优选的，所述野生型PCV2病毒DNA上存在用于与STAT5蛋白结合的GAS样基序。优选的，所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的PCV22b亚型毒株)DNA自复制起始点起的第1066nt～1074nt存在的GAS样基序(TTCTCTGAA)。优选的，通过将上述GAS样基序突变为非GAS样基序(例如，ACGAAAGCC)，使得PCV2DNA(基因组DNA)在病毒复制中不能与宿主细胞蛋白STAT5结合，并导致PCV2病毒的复制能力明显减弱。优选的，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。上述突变的PCV2病毒的制备方法，包括以下步骤：1)通过序列比对分析PCV2病毒DNA包含的与STAT5蛋白保守的结合位点，然后扩增或人工合成突变的PCV2病毒的DNA序列，所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内；2)将上述突变的PCV2病毒的DNA序列环化后转染宿主细胞(例如，PK-15细胞)，然后进行培养和传代，得到突变的PCV2病毒。优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：根据GAS样基序是STAT5蛋白保守的结合位点，以野生型PCV2病毒DNA为模板，通过重叠PCR扩增得到GAS样基序突变的PCV2病毒DNA。优选的，所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的毒株)。优选的，所述重叠PCR采用的扩增引物为：病毒DNA片段I引物：Overlap-F1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTC-3’Overlap-R1：5’-ATGTATGTACAATGGCTTTCGTTAATCTGAAAGACCCC-3’病毒DNA片段II引物：Overlap-F2：5’-AGATTAACGAAAGCCTTGTACATACATGGTTACACGGATAT-3’Overlap-R2：5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’病毒DNA全长引物：Overlap-F1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTC-3’Overlap-R2：5’-GCACCGCGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’。上述突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物模型中的应用。例如，所述动物模型为感染突变的PCV2病毒的PK-15细胞。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术基于猪STAT5(PorcineSTAT5)蛋白与位于猪圆环病毒2型(PCV2)2b亚型毒株DNA1066nt～1074nt的GAS样基序(TTCTCTGAA)之间的互作，通过将PCV2DNA中的GAS样基序突变，并通过感染性克隆获得在复制中不能与STAT5蛋白结合的突变的PCV2毒株，该突变毒株复制更为缓慢，并且毒价低于野生型PCV2毒株。本专利技术获得的突变毒株可以用于更好的研究PCV2的复制机制，同时，由于本专利技术的突变毒株是从弱化病毒DNA复制的层面构建形成的弱毒PCV2毒株，从而为PCV2的防控提供了新思路，对疫苗研发具有重要意义。进一步的，本专利技术通过实验(序列比对、DNApulldown)确定了PCV2病毒DNA中存在的与STAT5蛋白结合的GAS样区域(GAS样基序)是STAT5蛋白保守的结合位点，从而为构建不同复制能力的低毒价突变毒株提供了有效的候选靶点。进一步的，本专利技术根据野生型PCV2序列(例如，GenBankNo.MH492006.1)，将PCV2病毒DNA第1066nt～1074nt的TTCTCTGAA突变为ACGAAAGCC，构建得到GAS样区域突变的PCV2感染性克隆，通过原位杂交实验发现PCV2突变毒株的DNA复制能力显著低于野生型PCV2毒株，该突变毒株可以作为研究PCV2DNA复制的一个重要模型。本专利技术首次证实PCV2病毒DNA存在与STAT5蛋白结合的互作区域(例如，GAS样区域)，可以根据结合位点设计定点突变引物(使得突变的PCV2DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合)，并通过重叠PCR获得突变的PCV2病毒DNA，从而通过感染性克隆快速构建获得复制能力远低于野生型PCV2毒株的突变毒株。附图说明图1为猪stat5基因克隆及真核表达载体的鉴定结果；其中：A为猪stat5基因的PCR产物鉴定，泳道M为DL2000plusDNAMarker，泳道1为猪stat5基因的PCR产物；B为pCI-His-STAT5酶切鉴定，泳道M为DL2000plusDNAMarker，泳道1为XhoI及NotI双酶切鉴定。图2为免疫共沉淀鉴定Cap和猪STAT5蛋白互作的结果；其中：A为利用His抗体进行免疫沉淀的结果；B为利用GFP抗体进行免疫沉淀的结果；Input表示裂解产物对照(未加入用于免疫沉淀的抗体)，IP表示免疫沉淀；β-actin为内参。图3为猪stat5原核表达载体的鉴定结果；其中：A为stat5基因的PCR产物鉴定，泳道M1为DL2000plusDNAMarker，泳道1、2为stat5基因的PCR产物；B为pGEX-4T-STAT5酶切鉴定，泳道M2为1KbDNAMarker，泳道1为原核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变的PCV2病毒，其特征在于：该突变的PCV2病毒的突变位点位于PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变的PCV2病毒，其特征在于：该突变的PCV2病毒的突变位点位于PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内。


2.根据权利要求1所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述与STAT5蛋白结合的序列区域为GAS样基序。


3.根据权利要求2所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述GAS样基序位于PCV2病毒DNA自复制起点开始的1066nt～1074nt。


4.根据权利要求1所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述突变的PCV2病毒是指病毒DNA序列中的片段TTCTCTGAA突变为非GAS样基序的PCV2病毒。


5.根据权利要求1所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。


6.根据权利要求1所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述突变的PCV2病毒不能与宿主细胞内的STAT5蛋白结合，并导致PCV2病毒的复...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，童德文，韩聪，杜谦，朱磊，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61