重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法技术

重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamHI和SalI两个酶切位点，插入pAAV‑MCS表达载体。本发明专利技术构建的重组RBD蛋白分泌表达的重组9型腺相关病毒载体及其细胞株，能够用于预防新型冠状病毒2019‑nCoV病毒载体疫苗，满足当前预防新型冠状病毒2019‑nCoV疫苗的急需，在进一步安全实验验证的前提下，可望大面积推广，对人类实现长期有效的免疫保护。

【技术实现步骤摘要】
重组新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区9型腺相关病毒的构建方法
本专利技术涉及用于表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(RBD)的重组表达病毒载体和重组9型腺相关病毒及其制备方法，进一步涉及含有表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒载体的用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗。
技术介绍
2019-2020年，新型冠状病毒2019-nCoV在全球爆发，针对该新型冠状病毒的治疗药物和疫苗成为研发的焦点。2019-nCoV是正链RNA病毒，属于冠状病毒家族，之前从未在人体见诸报道。2019-nCoV感染人体后，会导致肺部感染，严重的导致死亡。目前的研究表明，2019-nCoV通过其刺突糖蛋白上的受体结合区(RBD)与人体细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，从而引发病毒对体细胞的入侵。因此，RBD区成为新冠病毒治疗药物和疫苗开发的重要靶点。在疫苗的实际应用中，保护期是一项重要的指标，腺相关病毒在感染人体后，可在人体持续表达8年以上，将腺相关病毒用于疫苗的开发具有很好的前景。本专利技术涉及一种分泌型表达重组RBD蛋白的重组9型腺相关病毒的构建及病毒包装纯化，可在感染细胞后，将表达的重组RBD蛋白分泌到细胞培养上清中，可应用于2019-nCoV病毒载体疫苗的开发。
技术实现思路
本专利技术目的是构建能够将重组RBD蛋白分泌表达的重组9型腺相关病毒载体及其细胞株，进一步提供一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV病毒载体疫苗。本专利技术的目的是这样实现的：一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：由pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因构成。本专利技术的目的还可以这样实现：所述的重组腺相关病毒为重组9型腺相关病毒-tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。所述的双RBD基因由柔性Linker连接。本专利技术所述的重组腺相关病毒采用如下方法制备而成：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamHI和SalI两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体。本专利技术提供一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒转染的细胞株，其特征在于：含有pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。本专利技术提供一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗，其特征在于：含有权利要求1-4其中之一所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒。本专利技术一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamHI和SalI两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体；具体步骤为：1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamHI和SalI双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine3000按0.5ug/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗WesternBlot检测；3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用SmaI酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性。本专利技术一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：第一步，重组9型腺相关病毒-RBD的制备1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamHI和SalI双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine3000按0.5ug/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗WesternBlot检测；3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用SmaI酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性；第二步，重组9型腺相关病毒-RBD的包装1)接种HEK293细胞至10cm培养皿中，密度为40000cell/cm2；2)培养24h后，对其中一皿细胞计数；3)按1ug质粒/100万细胞，计算需转染细胞的质粒总量；4)重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help三种质粒按照质量比1:1:1，确定各质粒的用量；5)FectoVIR-AAV用量和转染质粒总量按照1uL:1ug的比例，确定FectoVIR-AAV的用量；6)将确定用量的三种质粒加入0.5mL高糖DMEM培养基中，涡旋3-4s混匀；7)将确定好用量的FectoVIR-AAV加入6)中，涡旋3-4s混匀；8)室温孵育30min后，滴入HEK293细胞中；9)37℃，5％CO2孵育72h。第三步，重组9型腺相关病毒-RBD的纯化1)分别收集第二步9)的细胞培养上清和细胞；2)将收集的细胞用1mLPBS重悬；3)将重悬的细胞放入液氮和室温，反复冻融3次，每次融化后剧烈震荡2min，以破碎细胞，释放病毒；4)将反复冻融的细胞在4℃，12000rpm离心10min，收集裂解物上清；5)将4)中裂解物上清并入1)中细胞培养上清中，即为收获的重组AAV病毒粗制品；6)按50U/mL加入Benzonase至5)中，去除未包装残余DNA；7)37℃孵育30min，每10min翻转以确保Benzonase混合均匀；8)4℃，12000rpm离心20min，取上清；9)上清用0.45um滤器过滤，放入新管；10)将上述上清放入超速离心管，进行密度梯度离心(碘克沙醇)；11)称重配平后，301580g，12℃，离心1h40min；12)收集病毒液透明部分，脱盐、浓缩；13)纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD和对照病毒分别用AAVproTitrationKitVer.2检测病毒滴度，按说明书进行Q-PCR检测；纯化后的重组9型腺相关病毒-RBD经试剂盒检测，病毒液滴度为2.05×1013vg/mL。...

【技术保护点】
1.一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：由pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：由pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因构成。


2.根据权利要求1所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：所述的重组腺相关病毒为重组9型腺相关病毒-tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。


3.根据权利要求1或2所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：所述的双RBD基因由柔性Linker连接。


4.根据权利要求1所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒，其特征在于：采用如下方法制备而成：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamHI和SalI两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体。


5.权利要求1-4所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒转染的细胞株，其特征在于：含有pAAV-MCS表达载体中插入tPA分泌信号肽连接的双RBD基因。


6.一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗，其特征在于：含有权利要求1-4其中之一所述的表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒。


7.一种表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于：将2段RBD序列用柔性Linker串联连接，再在前面加上tPA分泌表达信号肽，以BamHI和SalI两个酶切位点，插入pAAV-MCS表达载体；具体步骤为：
1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamHI和SalI双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；
2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine3000按0.5ug/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗WesternBlot检测；
3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用SmaI酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性。


8.一种用于预防新型冠状病毒2019-nCoV的疫苗的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：
第一步，重组9型腺相关病毒-RBD的制备
1)重组表达质粒的构建：将合成的插入基因和pAAV-MCS载体分别用BamHI和SalI双酶切后，回收连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Kana抗体的LB培养基，筛选阳性克隆，鉴定后送出测序；
2)重组表达质粒转染细胞后并验证：a)接种HEK293细胞至24孔板，4-5万细胞/孔；b)接种第二天换液，2h后用Lipofectamine3000按0.5ug/孔转染重组质粒至细胞中；c)37℃，5％CO2孵育6h；d)换液，继续培养24-48h；e)分别收集24小时后细胞裂解物和细胞培养上清，以及48小时后细胞培养上清，用抗RBD单抗WesternBlot检测；
3)重组表达质粒的大量提取：将重组表达质粒、pAAV-RC9、pAAV-Help大量培养后，按质粒大提试剂盒的步骤进行，最后测定质粒浓度，并用SmaI酶切重组表达质粒，以验证该质粒的完整性；
第...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军志，饶春明，秦玺，李永红，李山虎，李响，丁有学，裴德宁，刘兰，史新昌，于雷，周勇，郭莹，韩春梅，朱留强，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11