合成嵌合痘苗病毒制造技术

本发明专利技术在各个方面涉及合成嵌合痘苗病毒或包含该病毒的组合物，以及用于产生该合成嵌合痘苗病毒的系统和方法的开发与应用。该合成嵌合痘苗病毒尤其非常适合作为病毒疫苗或产生溶瘤反应和药物制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成嵌合痘苗病毒
技术介绍
与本申请相关的序列表通过EFS-Web以文本格式电子提交，并且由此通过引用完整地结合到说明书中。含有序列表的文本文件的名称为104545-0031-WO-SequenceListing.txt。文本文件在2019年5月2日创建，大小为288,652字节。痘病毒(痘病毒科(Poxviridae)的成员)是可感染人和动物两者的双链DNA病毒。痘病毒基于宿主范围分为两个亚科。感染脊椎动物宿主的脊椎动物痘病毒(Chordopoxviridae)亚科由八个属组成，已知其中的四个属(正痘病毒属(Orthopoxvirus)、副痘病毒属(Parapoxvirus)、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)和亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus))会感染人类。天花是由天花病毒(variolavirus，VARV)感染引起，所述天花病毒是正痘病毒属(OPV)的成员。OPV属包括许多遗传上相关且形态上相同的病毒，包括骆驼痘病毒(camelpoxvirus，CMLV)、牛痘病毒(cowpoxvirus，CPXV)、鼠痘病毒(ectromeliavirus，ECTV、“鼠痘试剂”)、马痘病毒(horsepoxvirus，HPXV)、猴痘病毒(monkeypoxvirus，MPXV)、兔痘病毒(rabbitpoxvirus，RPXV)、浣熊痘病毒(raccoonpoxvirus)、臭鼬痘病毒(skunkpoxvirus)、沙鼠痘病毒(Taterapoxvirus)、瓦辛吉舒病病毒(UasinGishudiseasevirus)、痘苗病毒(vacciniavirus，VACV)、天花病毒(variolavirus，VARV)和田鼠痘病毒(volepoxvirus，VPV)。除了VARV以外，已知至少三种其他OPV(包括VACV、MPXV和CPXV)会感染人类。迄今，用“活”VACV疫苗接种是唯一经证实可以抵御天花的保护。一项积极的疫苗接种计划导致于1980年消灭了天花，停止了公众的常规天花疫苗接种。然而，仍然需要寻找针对VARV和其他OPV的新的安全且有效的个体疫苗接种的方法。VACV的多种制剂已经用作天花疫苗。这些疫苗中的大多数由多种相关病毒组成(例如，Dryvax)，并且一种包含单个分子克隆ACAM2000。然而，类似Dryvax和其他VACV疫苗，甚至ACAM2000也与包括心肌病和心包炎的严重副作用相关。为了降低风险，ACAM2000疫苗与其他活疫苗相似，具有许多禁忌，排除患有癌症、免疫缺陷症的个体、器官移植受者、患有特应性皮炎、湿疹、银屑病、心脏病的患者和服用免疫抑制剂的患者。据估计，15-50％的美国人群属于这些类别之一，证实需要开发更安全的疫苗或疫苗接种方案(Kennedy等,2007KennedyR,PolandGA.2007.T-Cellepitopediscoveryforvariolaandvacciniaviruses.RevMedViroll7:93-113)。因此，需要开发一种功效类似于Dryvax或ACAM2000TM但是更安全的疫苗。生产安全、纯净、强力和有效的疫苗需要品质保证程序以保证疫苗生产过程的一致性和连贯性。过去，含胚胎的鸡蛋或初级鸡胚胎成纤维细胞培养物已经用于培养病毒以制备抵御黄热病、流感、麻疹和腮腺炎的疫苗。这些基质被认为是可接受的，因为认为可感染鸡的外源因子将不感染人类且不对人类致病(FDA简报文件疫苗和相关生物产品咨询委员会会议(FDABriefingDocumentVaccinesandRelatedBiologicalProductsAdvisoryCommitteeMeeting)，2012年9月19日)。然而，如果病毒嗜性变化，则可损害安全性。其他基质已经用于培养用于生产疫苗的病毒，诸如用于天花疫苗的小牛淋巴。在小牛接种天花后，提取含有白细胞的淋巴并将其保存在毛细管中。随后将这用于人的疫苗接种以预防天花。然而，存在被牛海绵状脑病或羊瘙痒病朊病毒污染的风险。尽管用于现代疫苗的规定和指南表明所有使用的材料必须来自无BSE的地区，但是没有关于无羊瘙痒病区域状态的任何规定和指南。特别关注的事实是在1980–1982年生产的Dryvax疫苗没有通过现代方法细察。具体地，这些储液没有进行关于外源因子的测试(Murphy和Osburn.EmergingInfectiousDiseases.www.cdc.gov/eid.卷11，No.7，2005年7月)。因此，需要开发一种疫苗，其功效类似于现有的Dryvax或ACAM2000TM疫苗，但是更安全、可复制并且不含残余细胞、残余DNA、朊病毒和外源因子。本申请提供从化学合成的DNA组装和复制的嵌合痘苗病毒，其是安全的、可复制的且不含污染物。因为化学基因组合成不依赖于天然模板，所以病毒基因组的多种结构和功能性修饰是可能的。当没有天然模板可用于遗传复制或通过常规分子生物学方法修饰时，化学基因组合成是尤其有用的。专利技术概述本专利技术的一个方面提供合成嵌合痘苗病毒、用于产生此类病毒的方法和该病毒例如作为免疫原、在免疫原性制剂中、在体外测定中、作为异源基因表达的载体或作为用于治疗癌症的溶瘤试剂的用途。本申请的合成嵌合痘苗病毒其特征在于相对于野生型痘苗病毒有一个或多个修饰。在一方面，本专利技术是基于可从化学合成的痘苗病毒基因组重叠片段产生合成嵌合痘苗病毒(例如，scVACV)的发现。因此，在一方面，本专利技术涉及合成嵌合痘苗病毒(例如scVACV)，所述病毒是从源于合成DNA的DNA复制和再激活的，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组的特征在于一个或多个修饰，所述修饰来源于包含化学合成的DNA、cDNA或基因组DNA的组。在另一方面，本专利技术涉及制备合成嵌合痘苗病毒(scVACV)的方法，其包括以下步骤：(i)化学合成对应于痘苗病毒的基本上全部病毒基因组的重叠DNA片段；(ii)将重叠DNA片段转染至辅助病毒感染的细胞中；(iii)培养所述细胞以在所述细胞中产生辅助病毒和合成嵌合痘苗颗粒的混合物；和(iv)将混合物铺板在对scVACV具有特异性的宿主细胞上以回收scVACV。在另一方面，本专利技术涉及通过本专利技术的方法产生的合成嵌合痘苗病毒(scVACV)。在另一方面，本专利技术涉及药物组合物，其包含本专利技术的合成嵌合痘苗病毒(scVACV)和药学上可接受的载体。在另一方面，本专利技术涉及一种在受试者中诱导溶瘤反应的方法，其包括向所述受试者施用包含本专利技术的scVACV的组合物。在另一方面，本专利技术涉及用于在宿主细胞中表达异源蛋白的方法，包括将异源核酸序列引入本专利技术的scVACV中，用scVACV感染宿主细胞，并在用于表达所述异源蛋白的条件下培养宿主细胞。在另一方面，本专利技术涉及一种触发或增强针对痘苗病毒的免疫反应的方法，其包括向有需要的受试者施用包含本专利技术的scVACV的组合物。在另一方面，本专利技术涉及一种触发或增强针对天花病毒感染的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成嵌合痘苗病毒(scVACV)，所述病毒是从源于合成DNA的DNA复制和再激活的，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组的特征在于一个或多个修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180502 US 62/665,9731.一种合成嵌合痘苗病毒(scVACV)，所述病毒是从源于合成DNA的DNA复制和再激活的，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组的特征在于一个或多个修饰。


2.根据权利要求1所述的scVACV，其中所述合成DNA选自以下的一种或多种：化学合成的DNA、PCR扩增的DNA、工程化改造的DNA和包含核苷类似物的多核苷酸。


3.根据权利要求1所述的scVACV，其中所述合成DNA是化学合成的DNA。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的scVACV，其中所述一个或多个修饰包括一个或多个缺失、插入、取代或其组合。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的scVACV，其中所述一个或多个修饰包括消除一个或多个独特的限制位点的一个或多个修饰。


6.根据权利要求1-4中任一项所述的scVACV，其中所述一个或多个修饰包括添加或修复一个或多个独特的限制位点的一个或多个修饰。


7.根据权利要求1-5中任一项所述的scVACV，其中所述一个或多个修饰包括消除一个或多个AarI限制位点的一个或多个修饰。


8.根据权利要求1-5中任一项所述的scVACV，其中所述一个或多个修饰包括消除所有AarI限制位点的一个或多个修饰。


9.根据权利要求1-5中任一项所述的scVACV，其中所述一个或多个修饰包括消除一个或多个BsaI限制位点的一个或多个修饰。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的scVACV，其中所述病毒基因组包含异源末端发夹环。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的scVACV，其中所述病毒基因组包含来源于不同痘苗病毒株的末端发夹环。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的scVACV，其中所述病毒基因组包含来源于VACVWR株的末端发夹环。


13.根据权利要求1-9中任一项所述的scVACV，其中所述病毒基因组包含同源或异源末端发夹环，并且其中串联重复区包含与wtVACV不同数量的重复。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的scVACV，其中所述病毒基因组是选择由以下组成的组的VACV株的基因组：WesternReserve、克隆3、TianTian、TianTian克隆TP5、TianTian克隆TP3、NYCBH、NYCBH克隆Acambis2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister107、Lister-LO、ListerGL-ONC1、ListerGL-ONC2、ListerGL-ONC3、ListerGL-ONC4、ListerCTC1、ListerIMG2(TurboFP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent克隆TKT3、Tashkent克隆TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、ConnaughtLaboratories、Serro2、CM-01、NYCBHDryvax克隆DPP13、NYCBHDryvax克隆DPP15、NYCBHDryvax克隆DPP20、NYCBHDryvax克隆DPP17、NYCBHDryvax克隆DPP21、VACV-IOC、安卡拉绒毛膜尿囊痘苗病毒(CVA)、改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)和MVA-BN。


15.根据权利要求14所述的scVACV，其中所述scVACV的病毒基因组是基于NYCBH株克隆Acambis2000的基因组。


16.根据权利要求14所述的scVACV，其中所述scVACV的病毒基因组是基于NYCBH株克隆Dryvax的基因组。


17.根据权利要求14所述的scVACV，其中所述scVACV的病毒基因组是基于Lister株V-VET1的基因组。


18.根据权利要求14所述的scVACV，其中所述scVACV的病毒基因组是基于改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)株的基因组。


19.根据权利要求14所述的scVACV，其中所述scVACV的病毒基因组是基于MVA-BN株的基因组。


20.根据权利要求14所述的scVACV，其中所述scVACV的病毒基因组是基于IOC株的基因组。


21.根据权利要求1-20中任一项所述的scVACV，其中所左侧末端发夹环和右侧末端发夹环：a)分别包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式和快速形式，b)分别包含痘苗病毒末端发夹环的快速形式和慢速形式，c)都包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式，或d)都包含痘苗病毒末端环的快速形式。


22.根据权利要求21所述的scVACV，其中所述慢速形式包含与SEQIDNO:13或SEQIDNO:19的核苷酸序列至少85％相同的核苷酸序列，并且所述快速形式包含与SEQIDNO:14或SEQIDNO:20的核苷酸序列至少85％相同的核苷酸序列。


23.根据权利要求22所述的scVACV，其中所述慢速形式包含与SEQIDNO:13或SEQIDNO:19的序列至少90％相同的核苷酸序列，并且所述快速形式包含与SEQIDNO:14或SEQIDNO:20的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。


24.根据权利要求23所述的scVACV，其中所述慢速形式包含与SEQIDNO:13或SEQIDNO:19的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列，并且所述快速形式包含与SEQIDNO:14或SEQIDNO:20的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。


25.根据权利要求24所述的scVACV，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·埃文斯，瑞安·诺伊斯，塞思·莱德曼，
申请(专利权)人：戴维·埃文斯，瑞安·诺伊斯，通尼克斯制药控股有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA