构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用。本发明专利技术分别包装表达位点特异重组酶的腺相关病毒oAAV‑SSR，及携带位点特异序列和倒转GSDM‑NT序列的腺相关病毒oAAV‑SS‑GSDM‑NT，从而避免了包装过程中具有很强细胞毒性的焦亡蛋白的表达，成功获得了安全，高效，高滴度的溶瘤腺相关病毒oAAVs，该溶瘤腺相关病毒在体外可使多种肿瘤细胞发生焦亡，具有很好的肿瘤细胞杀伤作用，在体内可用于治疗动物肿瘤模型。oAAVs与免疫调节剂组合构成的肿瘤治疗组合药剂，在动物肿瘤模型上比单独使用oAAVs或免疫调节剂都具有更显著的溶瘤效果，说明该肿瘤治疗组合药剂具有很好的肿瘤治疗应用前景。

【技术实现步骤摘要】
构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用
本专利技术涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用。
技术介绍
细胞焦亡是一种由成孔蛋白家族gasderminsN段结构域介导的细胞胀大破裂并释放出大量炎症物质的细胞程序化死亡。诱使肿瘤细胞发生焦亡，不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，又可以触发强烈的抗肿瘤免疫反应，与免疫筛查位点PD-1/PD-L1阻断联合应用，可以发挥很好的溶瘤效果。诱发肿瘤焦亡的方法是运用载体递送成孔蛋白家族gasderminsN段结构域(GSDM-NT)基因至肿瘤细胞内。目前已有的溶瘤病毒载体包装方法在包装时都无法避免目的基因(GSDM-NT)的表达，而GSDM-NT具有很强的细胞毒性，一旦在内部表达连细菌都会发生焦亡，最终无法包装获得表达焦亡蛋白的溶瘤病毒载体。目前没有表达焦亡蛋白(GSDM-NT)的溶瘤病毒的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用，该溶瘤腺相关病毒安全、高效、可用于人体及宠物治疗肿瘤。为实现上述目的，本专利技术所设计一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，包括以下步骤：1)扩增获得焦亡蛋白基因从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因(GSDM-NT)；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；2)包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR2.1构建核心质粒pAAV-SS-GSDM-NTa.将pAAV-SS质粒用AscI及NheI进行双酶切，回收载体片段AAV-SS；b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有AscI及NheI酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用AscI及NheI进行双酶切回收后与载体片段AAV-SS连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT；2.2三质粒共转染包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSRa.无内毒素提取pAAV-SS-GSDM-NT、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT与辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，按照摩尔比1:1:1的比例，用阳离子转染试剂PEI共转染HEK293T细胞，72小时后收取细胞，按照2×107个细胞每1mlPBS的比例，重悬HEK293T细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清，后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩。采用荧光定量PCR对oAAV-SS-GSDM-NT滴度进行测定；b.利用上述方法，使用核心质粒pAAV-SSR、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-SSR，采用荧光定量PCR对oAAV-SSR滴度进行测定；3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs将oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR滴度均调整至2×1012病毒粒子/毫升(vg/ml)后等比例混合获得oAAVs，分装后于-80℃保存。进一步地，所述步骤1)中，人类焦亡蛋白基因选自GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDMD-NT和GSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～5所示；具体如下：GSDMA-NT序列：5’-atgaccatgtttgaaaatgtcacccgggccctggccagacagctaaaccctcgaggggacctgacaccacttgacagcctcatcgacttcaagcgcttccatcccttctgcctggtgctgaggaagaggaagagcacgctcttctggggggcccggtacgtccgcaccgactacacgctgctggatgtgcttgagcccggcagctcaccttcagacccaacagacactgggaattttggctttaagaatatgctggacacccgagtggagggagatgtggatgtaccaaagacggtgaaggtgaagggaacggcagggctctcgcagaacagcactctggaggtccagacactcagtgtggctcccaaggccctggagaccgtgcaggagaggaagctggcagcagaccacccattcctgaaggagatgcaagatcaaggggagaacctgtatgtggtgatggaggtggtggagacggtgcaggaggtcacactggagcgagccggcaaggcagaggcctgcttctccctccccttcttcgccccattggggctacagggatccataaatcacaaggaggctgtaaccatccccaagggctgcgtcctggcctttcgagtgagacagctgatggtcaaaggcaaagatgagtgggatattccacatatctgcaatgataacatgcaaaccttccctcctggagaaaagtcaggagaggagaaggtcatccttatccaggcatctgatgttgggtga-3’；GSDMB-NT序列：5’-atgttcagcgtatttgaggaaatcacaagaattgtagttaaggagatggatgctggaggggatatgattgccgttagaagccttgttgatgctgatagattccgctgcttccatctggtgggggagaagagaactttctttggatgccggcactacacaacaggcctcaccctgatggacattctggacacagatggggacaagtggttagatgaactggattctgggctccaaggtcaaaaggctgagtttcaaattctggataatgtagactcaacgggagagttgatagtgagattacccaaagaaataacaatttcaggcagtttccagggcttccaccatcagaaaatcaagatatcggagaaccggatatcccagcagtatctggctacccttgaaaacaggaagctgaagagggaactacccttttcattccgatcaattaatacgagagaaaacctgtatctggtgacagaaactctggagacggtaaaggaggaaaccctgaaaagcgaccggcaatataaattttggagccagatctctcagggccatctcagctataaacacaagggccaaag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)扩增获得焦亡蛋白基因/n从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；/n2)包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR/n2.1构建核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT/na.将pAAV-SS质粒用Asc I及Nhe I进行双酶切，回收载体片段AAV-SS；/nb.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有Asc I及Nhe I酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用Asc I及Nhe I进行双酶切回收后与载体片段AAV-SS连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT；/n2.2三质粒共转染包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR/na.无内毒素提取pAAV-SS-GSDM-NT、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT与辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染HEK 293T细胞；重悬HEK 293T细胞后，反复冻融和离心，收集含重组腺相关病毒上清；然后经孵育、纯化和浓缩；得到oAAV-SS-GSDM-NT；/nb.利用上述方法，使用质粒pAAV-SSR、质粒pAAV-DJ和质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-SSR；/n3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs/n将oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR混合获得oAAVs，分装后于-80℃保存。/n...

【技术特征摘要】
1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)扩增获得焦亡蛋白基因
从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；
2)包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR
2.1构建核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT
a.将pAAV-SS质粒用AscI及NheI进行双酶切，回收载体片段AAV-SS；
b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有AscI及NheI酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用AscI及NheI进行双酶切回收后与载体片段AAV-SS连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT；
2.2三质粒共转染包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR
a.无内毒素提取pAAV-SS-GSDM-NT、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT与辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染HEK293T细胞；重悬HEK293T细胞后，反复冻融和离心，收集含重组腺相关病毒上清；然后经孵育、纯化和浓缩；得到oAAV-SS-GSDM-NT；
b.利用上述方法，使用质粒pAAV-SSR、质粒pAAV-DJ和质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-SSR；
3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs
将oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR混合获得oAAVs，分装后于-80℃保存。


2.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤1)中，人类焦亡蛋白基因选自GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDMD-NT和GSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～5所示；
小鼠焦亡蛋白基因选自mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT和mGSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQIDNO：6～8所示。


3.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤2)第2.1的a中，pAAV-SS质粒为带有Cre重组酶特异识别的特异位点序列Lop的pAAV-Lop质粒或带有Flp重组酶特异识别的特异位点序列FRT的pAAV-FRT质粒；其中，pAAV-Lop质粒的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，pAAV-FRT质粒的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。


4.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤2)第2.1的b中，GSDM-NT扩增引物为：
GSDMA-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgaccatgtttgaaaatgtcac-3’；
GSDMA-NT-R：5’-ctagctagctcacccaacatcagatgcctg-3’；
GSDMB-NT的引物：
GSD...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，鲁愿，何文波，黄信，刘小可，何雨，陶大刚，张茜，姜雪梨，徐伟泽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42