构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV‑SP‑GSDM‑NT的包装方法及其应用。本发明专利技术利用哺乳动物特异启动子SP和sf9昆虫细胞包装oAAV‑SP‑GSDM‑NT，避免了包装过程中具有很强细胞毒性的焦亡蛋白的表达，成功获得了安全，高效，高滴度的oAAV‑SP‑GSDM‑NT，其在体外可使多种肿瘤细胞发生焦亡，具有很好的肿瘤细胞杀伤作用，在体内可用于治疗动物肿瘤模型。oAAV‑SP‑GSDM‑NT与免疫调节剂联合形成治疗肿瘤的组合药剂，在动物肿瘤模型上比单独使用oAAV‑SP‑GSDM‑NT或免疫调节剂都具有更显著的溶瘤效果，说明该肿瘤治疗组合药剂具有很好的肿瘤治疗应用前景。

【技术实现步骤摘要】
构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法及其应用
本专利技术涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法及其应用。
技术介绍
细胞焦亡是一种由成孔蛋白家族gasderminsN段结构域介导的细胞胀大破裂并释放出大量炎症物质的细胞程序化死亡。诱使肿瘤细胞发生焦亡，不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，又可以触发强烈的抗肿瘤免疫反应，与免疫筛查位点PD-1/PD-L1阻断联合应用，可以发挥很好的溶瘤效果。诱发肿瘤焦亡的方法是运用载体递送成孔蛋白家族gasderminsN段结构域(GSDM-NT)基因至肿瘤细胞内。目前已有的溶瘤病毒载体包装方法在包装时都无法避免目的基因(GSDM-NT)的表达，而GSDM-NT具有很强的细胞毒性，一旦在内部表达连细菌都会发生焦亡，最终无法包装获得表达焦亡蛋白的溶瘤病毒载体。目前没有表达焦亡蛋白(GSDM-NT)的溶瘤病毒的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法及其应用，该溶瘤腺相关病毒安全、高效、可用于人体及宠物治疗肿瘤。为实现上述目的，本专利技术所设计一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法，包括以下步骤：1)扩增特异启动子(SpecificPromoters，SP)，构建供体质粒pFastBac-ITR-SP-eGFPa.设计扩增引物，从质粒pMD18T-mCBA(包含哺乳动物特异启动子mCBA)或HEK293T细胞基因组(包含哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT)中扩增获得特异启动子SP片段；其中，所述特异启动子SP片段为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；b.利用分子克隆技术替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP；2)扩增获得焦亡蛋白基因从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因(GSDM-NT)；其中，焦亡蛋白的基因选自人类焦亡蛋白基因和小鼠焦亡蛋白基因；3)构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒3.1构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组供体质粒a.将pFastBac-ITR-SP-eGFP质粒用EcoRI及BamHI进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-mCBA；b.设计扩增引物，以GSDMN为模板，扩增获得两端含有EcoRI及BamHI酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用EcoRI及BamHI进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-SP连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT；3.2构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒提取重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coliDH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落，扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒；3.3构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒将含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒；按照感染复数(MOI)＝0.1的比例，将第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-SP-GSDM-NT病毒；使用空斑实验测定第二代病毒滴度，以保证其滴度大于1×108pfu/ml；4.oAAV-SP-GSDM-NT包装及纯化扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，以保证其滴度大于1×108pfu/ml；按照每种病毒感染复数(MOI)＝1的比例，接种rBac-SP-GSDM-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞(2×106cells/ml)中，27℃震荡培养72小时后，按照500×g/min转速，离心收取感染的sf9昆虫细胞；按照2×107个细胞每1mlPBS的比例，重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清；后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩，得到溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT，采用荧光定量PCR对oAAV-SP-GSDM-NT滴度进行测定，分装后于-80℃保存。进一步地，所述步骤1)中所述特异启动子为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；其中，哺乳动物特异启动子mCBA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：5’-gccgtaatgagacgcacaaactaatatcacaaactggaaatgtctatcaatatatagttgctctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgcatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggt本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)扩增特异启动子，构建供体质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP/na.设计扩增引物，从质粒pMD18T-mCBA或HEK 293T细胞基因组中扩增获得特异启动子SP片段；其中，所述特异启动子SP片段为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；/nb.利用分子克隆技术替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP；/n2)扩增获得焦亡蛋白基因/n从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；/n3)构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒/n3.1构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组供体质粒/na.将pFastBac-ITR-SP-eGFP质粒用EcoR I及BamH I进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-mCBA；/nb.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有EcoR I及BamHI酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用EcoR I及BamH I进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-SP连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT；/n3.2构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒/n提取重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coliDH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落，扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒；/n3.3构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒/n将含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒；将第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-SP-GSDM-NT病毒；/n4.oAAV-SP-GSDM-NT包装及纯化/n扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，接种rBac-SP-GSDM-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞中，27℃震荡培养72小时后，离心收取感染的sf9昆虫细胞；重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，离心收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶混匀，水浴锅中孵育，离心收集上清；进一步纯化、超滤浓缩，得到溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT。/n...

【技术特征摘要】
1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)扩增特异启动子，构建供体质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP
a.设计扩增引物，从质粒pMD18T-mCBA或HEK293T细胞基因组中扩增获得特异启动子SP片段；其中，所述特异启动子SP片段为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；
b.利用分子克隆技术替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP；
2)扩增获得焦亡蛋白基因
从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；
3)构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒
3.1构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组供体质粒
a.将pFastBac-ITR-SP-eGFP质粒用EcoRI及BamHI进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-mCBA；
b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有EcoRI及BamHI酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用EcoRI及BamHI进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-SP连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT；
3.2构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒
提取重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coliDH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落，扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒；
3.3构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒
将含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒；将第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-SP-GSDM-NT病毒；
4.oAAV-SP-GSDM-NT包装及纯化
扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，接种rBac-SP-GSDM-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞中，27℃震荡培养72小时后，离心收取感染的sf9昆虫细胞；重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，离心收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶混匀，水浴锅中孵育，离心收集上清；进一步纯化、超滤浓缩，得到溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT。


2.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法，其特征在于：所述步骤1)中所述特异启动子为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；其中，哺乳动物特异启动子mCBA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


3.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法，其特征在于：所述步骤1)步骤a中所述引物序列为：
扩增mCBA序列的引物：
mCBA-F:5’-ctgcggccgcacgcgtgccgtaatgagacgcacaaac-3’
mCBA-R:5’-ctttgtagtccattcagaattcagccgccggtcacacgccag-3’；
扩增hTERT序列的引物：
hTERT-F:5’-ctgcggccgcacgcgtggcccctccctcgggttacc-3’
hTERT-R...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，鲁愿，何文波，黄信，刘小可，何雨，陶大刚，张茜，姜雪梨，徐伟泽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42