一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种基于S基因断裂的AAV‑HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用。本发明专利技术采用同源重组的方法构建pAAV‑HBV1.04质粒，通过三质粒共转染293T细胞方法体外包装生产重组病毒。用重组病毒通过尾静脉注射免疫系统正常的C57BL/6小鼠形成HBV cccDNA持续存在的HBV慢性感染小鼠模型。本发明专利技术中的小鼠模型能产生真实HBV cccDNA并且能作为唯一得转录模板发挥功能。本发明专利技术构建的新型HBV慢性感染小鼠模型可用于研究长期慢性感染条件下HBV cccDNA形成和维持的机制，用于研究与免疫系统相关的问题，用于寻找和评估新的抗HBV药物。

【技术实现步骤摘要】
一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是嗜肝性DNA病毒，基因组为部分双链松弛环状DNA(RelaxedcircularDNA,rcDNA)，全长约3.2kb，是目前已知的最小的DNA病毒(Ganem,D.andA.M.Prince,HepatitisBvirusinfection--naturalhistoryandclinicalconsequences.NEnglJMed,2004.350(11):p.1118-29.)。HBV感染宿主细胞后其rcDNA会在宿主细胞细胞核中被DNA损伤修复系统修复为共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，cccDNA是病毒转录的模板。尽管疫苗能有效预防HBV感染，但是对全球约2.5亿慢性乙肝患者没有帮助(WHO.HepatitisBFactSheet.Availableat:https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b(Accessed:March2020)(2020).)。HBV慢性感染能导致逐渐恶化的肝疾病如肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌，仍然是严重的公共健康问题。HBV建立长期慢性感染不能被清除的主要原因是其复制中间体cccDNA无法被现有药物清除。目前美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗乙型肝炎的药物为干扰素α和核苷/核苷酸类似物，核苷/核苷酸类似物可以有效抑制病毒的复制，但是不能清除病毒感染已经建立的cccDNA池，停药后病毒复制反弹。干扰素α也能抑制病毒复制，但是存在副作用大，应答率低，费用昂贵等问题，也不能清除cccDNA池(Gregorek,H.,etal.,PersistenceofHBV-DNAinchildrenwithchronichepatitisBwhoseroconvertedtoanti-HBsantibodiesafterinterferon-alphatherapy:correlationwithspecificIgGsubclassresponsestoHBsAg.JHepatol,2005.42(4):p.486-90.)。研究HBV慢性感染机制和寻找新的能治愈乙型肝炎药物仍然是重大的科学问题。目前关于cccDNA生物学特征还不是很清楚，主要原因是缺乏合适的慢性感染模型。HBV长期慢性感染的原因是cccDNA的长期稳定存在，不能被彻底清除。因此建立合适的HBV慢性感染模型来寻找这些问题的答案十分关键。由于HBV感染进入肝细胞依赖受体NTCP介导，这导致HBV具有严格的宿主特异性，只有少数细胞和动物模型可以使用，这为HBV的深入研究带来了不便。HepG22.15是使用比较多的非感染型细胞系，其整合了HBV二倍体基因组到宿主基因组。因为与自然感染生理条件不同，所以实验结果不一定准确。HepG2-NTCP和Huh7-NTCP是过表达HBV特异性受体NTCP的感染型细胞系，但是需要高滴度的野生型病毒才能成功感染。人肝原代细胞PHH可以被HBV感染，是HBV研究的金标准，但是来源有限，价格昂贵也限制了其应用。在体外细胞水平证明有作用的药物在进入临床实验前需在动物活体水平验证药物有效性和安全性。HBV只能感染灵长类动物如黑猩猩，在自然界黑猩猩是濒临灭绝的动物，不能再供研究使用。猕猴能作为一种可选的体内模型，但高昂的成本也限制了其应用。小鼠是良好的小型实验室动物模型，成本低，易操作，但是小鼠肝细胞不支持HBV感染，由于不清楚的原因即使过表达人NTCP受体的小鼠肝细胞也不支持HBV复制。目前只有uPA/SCID小鼠可以支持HBV复制，因为缺乏免疫系统，不适合研究免疫相关的问题。HBV转基因小鼠由于和自然感染生理条件不同，实验结果也不一定准确。尽管上述例举的HBV研究模型均不完美，但这些模型在HBV致病机制研究和抗HBV药物的发现上仍发挥了重要作用。研究HBV慢性感染免疫相关和cccDNA长期稳定存在机制的问题仍需要更合适的模型。近来一些研究组报道了其他非感染型的HBV表达系统。通过在体外培养细胞转染含HBV基因组的质粒和从小鼠尾静脉用流体力学注射(Hydrodynamicinjection，HDI)含HBV基因组的质粒或腺相关病毒(AAV)的方法来支持HBV的复制。Huangetal.在2006年使用了pAAV-HBV1.2(携带具有复制能力的HBV基因组)质粒HDI小鼠尾静脉能建立慢性感染。但是注射小鼠只有40％建立了慢性感染。小鼠是否建立慢性感染与小鼠本身的遗传背景和AAV载体骨架均有关(Huang,L.R.,etal.,AnimmunocompetentmousemodelforthetoleranceofhumanchronichepatitisBvirusinfection.ProcNatlAcadSciUSA,2006.103(47):p.17862-7.)。在这之前慢性感染模型多使用HBV转基因小鼠，但是小鼠的操作是在非生理条件下进行，因此研究者想建立非转基因小鼠HBV慢性感染模型。Huangetal.在2012年发现小鼠尾静脉HDI低剂量的Ad-HBV(腺病毒载体含具有复制能力HBV基因组)也能建立小鼠慢性感染(Huang,L.R.,etal.,TransferofHBVgenomesusinglowdosesofadenovirusvectorsleadstopersistentinfectioninimmunecompetentmice.Gastroenterology,2012.142(7):p.1447-50.e3.)。Dionetal.在表达HLA-A2和HLA-DR1的小鼠尾静脉注射包装好的AAV，能高效转导小鼠肝细胞，克服病毒进入的困难，所有注射小鼠都能建立慢性感染(Dion,S.,etal.,Adeno-associatedvirus-mediatedgenetransferleadstopersistenthepatitisBvirusreplicationinmiceexpressingHLA-A2andHLA-DR1molecules.JVirol,2013.87(10):p.5554-63.)。Luciforaetal.用包装好携带HBV1.2倍基因组的AAV尾静脉注射小鼠，在肝脏中检测到了HBVcccDNA的持久形成。但是Dion和Lucifora构建的模型中HBVcccDNA是如何形成的不清楚，以及形成的HBVcccDNA是否发挥了功能也不确定。在2014年，Qietal.通过整合有loxp-嵌合内含子prcccDNA质粒和pCMV-Cre质粒转染培养细胞能形成rcccDNA。将loxp-嵌合内含子prcccDNA质粒尾静脉注射Alb-Cre转基因小鼠或用pr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒，其特征在于：将HBV基因组从S基因处断开使得AAV-HBV1.04本身无法支持HBV复制，只有当重组发生产生cccDNA后HBV复制才能发生，所述重组病毒载体质粒序列见SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒，其特征在于：将HBV基因组从S基因处断开使得AAV-HBV1.04本身无法支持HBV复制，只有当重组发生产生cccDNA后HBV复制才能发生，所述重组病毒载体质粒序列见SEQIDNO.3所示。


2.如权利要求1所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒的制备方法，其特征在于：扩增AAV载体骨架，以2倍体为模板扩增HBV目的片段，再通过同源重组方法构建到AAV载体质粒中；其中，所述HBV2倍体的核苷酸序列见SEQIDNO.2，用于扩增AAV载体骨架的引物序列见SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，用于扩增HBV目的片段的引物序列见SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示。


3.根据权利要求2所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒的制备方法，其特征在于：所述重组病毒包装的HBV基因型为D型或A、B、C、E...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏宇尘，李聪，钟有权，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42