一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法技术

本发明专利技术属于病毒双水相萃取技术领域，公开了一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒(SenecavirusA,SVA)粒子的方法，SVA繁殖；SVA的间接免疫荧光鉴定；三步双水相萃取方法的建立；SVA含量的测定；蛋白印迹试验；SVA的电子显微镜鉴定。本发明专利技术在SVA培养液中加入低浓度的聚乙二醇和无机盐后，除去细胞碎片，再加入聚乙二醇形成双水相体系即能够快速的获得浓缩纯化的猪SVA病毒粒子；通过双水相萃取技术可实现病毒粒子的快速分离，且病毒粒子回收率和纯度均较高，工艺简单、成本低；通过三步双水相萃取的方法，实现了从细胞培养液中浓缩纯化猪SVA病毒粒子的目的，并可在实验室和规模化生产中同时应用。

【技术实现步骤摘要】
一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法
本专利技术属于病毒双水相萃取
，尤其涉及一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法。
技术介绍
目前，双水相萃取技术是利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术，但其原理到目前还不清楚。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，从而实现对目标物质的分离。双水相萃取技术作为一种新型的分离提纯方法在多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织及重金属分离领域广泛应用，较之超滤、层析等方法，双水相萃取技术对设备要求低，条件温和易于物质活性的保存，且操作简单，易于放大，在生物活性物质领域的分离具有广阔前景。塞内卡病毒病是由小核糖核酸科塞内卡病毒属的塞内卡病毒A(SenecavirusA,SVA)引起的一种主要感染猪的病毒性传染病。该病主要通过接触传播，可引起猪的蹄部、鼻吻等出现水泡病变，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等疾病在临床上难以区分。目前，用PK-15或BHK-21细胞并采用贴壁培养的方式分离培养SVA，但由于病毒产量低，一般小于1μg/mL，而宿主细胞的蛋白产量可达1000μg/mL，如何将SVA病毒粒子从宿主蛋白中分离纯化成为技术难点。超滤和PEG沉淀是常用的浓缩纯化病毒的方法，超滤技术虽然抗原回收率很高，但浓缩作用强于纯化作用，在提高病毒含量的同时，宿主蛋白也被成倍提高，且同时需要专业的设备；PEG沉淀技术纯度很高，但病毒回收率较低，且样品浓缩纯化时间较长，且需要配合离心等技术，亦需要专业的设备。双水相萃取技术由于条件温和，且能够很好的保留病毒活性，近年在病毒浓缩纯化方面广泛利用，如流感病毒、脊髓灰质炎病毒等。动物病毒性疫苗在预防动物病毒性疾病中发挥着重要作用，但由于动物疫苗价格低廉，且生产规模较大，如何将双水相萃取技术应用与动物疫苗的生产中面临着不小的挑战。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)超滤技术虽然抗原回收率很高，但浓缩作用强于纯化作用，在提高病毒含量的同时，宿主蛋白也被成倍提高，且同时需要专业的设备。故只能用于病毒纯化的初始阶段，目的在于减小体积。(2)PEG沉淀病毒的纯度很高，但病毒回收率较低，且样品浓缩纯化时间较长，且需要配合离心等技术，亦需要专业的设备。PEG纯化容易造成的病毒的丢失，对于低廉的动物疫苗不利成本的降低。解决以上问题及缺陷的难度为：超滤和PEG纯化的固有特点，不仅限制了其在动物疫苗大规模生产中的应用，同时也不利于疫苗质量的提高。解决以上问题及缺陷的意义为：开发简单、实用、低廉的病毒浓缩纯化方法，适合我国动物疫苗行业发展的特点，利于动物疫苗质量的稳步提高。双水相萃取技术由于条件温和，能够很好的保留病毒活性，且不需要专门的设备，易于操作。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法。本专利技术是这样实现的，一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，所述双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括以下步骤：步骤一，SVA繁殖；大量繁殖SVA，获得较多的SVA病毒液；步骤二，SVA的间接免疫荧光鉴定；用间接免疫荧光的方法鉴定大量繁殖的SVA，确定该病毒为SVA，并可初步判断SVA的含量；步骤三，三步双水相萃取方法的建立；获得纯化的SVA病毒粒子；步骤四，猪SVA含量的测定；测定纯化的SVA病毒粒子的含量；步骤五，蛋白印迹试验；对纯化的SVA病毒粒子进行WB验证；步骤六，SVA的电子显微镜鉴定，对纯化的病毒粒子进行电镜检测。进一步，步骤一中，所述SVA的繁殖方法，包括：(1)将分离SVAHN/11/2017接种于长成单层的含8％牛血清的BHK-21细胞，并在5％CO2、37℃条件下培养；(2)待细胞病变达到80％以上时收毒，并用间接免疫荧光的方法进行鉴定；(3)将细胞病毒液放于-20℃以下反复冻融二次，使病毒从细胞内完全释放出来，得到病毒悬液。进一步，步骤二中，所述SVA的间接免疫荧光鉴定，包括：(1)将SVAHN/11/2017毒株以1MOI的量接种于生长至50％以上满的BHK-21细胞的6孔板，37℃条件下孵育8h后弃上清；(2)经PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用含0.2％TritonX-100的PBS通透15min，PBS洗涤3次后用含5％BSA的PBS封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清，37℃孵育1h；(3)PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS洗涤3次后置荧光显微镜下观察并拍照。进一步，步骤三中，所述三步双水相萃取方法的建立，包括：(1)双水相萃取体系成相盐的选择按照以前报道的双水相萃取体系的相图，选用硫酸铵、硫酸钠、磷酸钠作为成相盐并和PEG6000组成双水相萃取体系，盐和聚乙二醇的浓度分别为16％和6％，成相体系的pH值均为8.0。后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，计算病毒回收率，确定双水相萃取体系。(2)第一步双水相萃取在病毒悬液中加入2％的氯仿，并振荡10min；在4℃条件下，以8000rpm/min离心10min，弃沉淀，取上清，得到澄清的病毒液；在澄清病毒液中加入双水相萃取成相物质，但并不使溶液分相，用氨水将体系的pH值调整为8.0，振荡10min后，在4℃条件下，以8000rpm/min离心5min，弃沉淀，取上清，进一步澄清病毒液。(3)第二步双水相萃取在第一步双水相萃取体系中补加聚乙二醇使其终浓度达到6％，形成硫酸铵/聚乙二醇双水相体系，并加入0.5％的氯化钠，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，使双水相体系彻底分相，病毒进入中间相和上相聚乙二醇相，并确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布。(4)第三步双水相萃取取出硫酸氨相，加入不同浓度的磷酸盐缓冲液，并加入0.3％的氯化钾，形成磷酸盐/聚乙二醇的双水相萃取体系，振荡混匀，后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量。进一步，步骤(2)中，所述双水相萃取成相物质为聚乙二醇和硫酸铵溶液。进一步，步骤(3)中，所述确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布，包括：将双水相萃取体系的pH值分别调整为7.5和8.0，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布。进一步，步骤四中，所述猪SVA含量的测定，包括：(1)用蔗糖密度梯度离心的方法定量SVA的含量；(2)将经三步双水相萃取体系纯化的SV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括：/nSVA繁殖；繁殖SVA，获得SVA病毒液；/nSVA的间接免疫荧光鉴定；用间接免疫荧光的方法鉴定大量繁殖的SVA，确定该病毒为SVA，并可初步判断SVA的含量；/n三步双水相萃取方法的建立；获得纯化的SVA病毒粒子；/nSVA含量的测定；测定纯化的SVA病毒粒子的含量；/n蛋白印迹试验；对纯化的SVA病毒粒子进行WB验证；/nSVA的电子显微镜鉴定，对纯化的病毒粒子进行电镜检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括：
SVA繁殖；繁殖SVA，获得SVA病毒液；
SVA的间接免疫荧光鉴定；用间接免疫荧光的方法鉴定大量繁殖的SVA，确定该病毒为SVA，并可初步判断SVA的含量；
三步双水相萃取方法的建立；获得纯化的SVA病毒粒子；
SVA含量的测定；测定纯化的SVA病毒粒子的含量；
蛋白印迹试验；对纯化的SVA病毒粒子进行WB验证；
SVA的电子显微镜鉴定，对纯化的病毒粒子进行电镜检测。


2.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的繁殖方法，包括：
(1)将分离的SVAHN/11/2017接种于长成单层的BHK-21细胞，并在5％CO2、37℃条件下培养；
(2)待细胞病变达到80％以上时收毒，并用间接免疫荧光的方法进行鉴定；
(3)将细胞病毒液放于-20℃以下反复冻融2次，使病毒从细胞内完全释放出来，得到病毒悬液。


3.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的间接免疫荧光鉴定，包括：
(1)将SVAHN/11/2017毒株以1MOI的量接种于生长至50％以上满的BHK-21细胞的6孔板，37℃条件下孵育8h后弃上清；
(2)经PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用含0.2％TritonX-100的PBS通透15min，PBS洗涤3次后用含5％BSA的PBS封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清，37℃孵育1h；
(3)PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS洗涤3次后置荧光显微镜下观察并拍照。


4.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述三步双水相萃取方法的建立，包括：
(1)双水相萃取体系成相盐的选择，按照双水相萃取体系的相图，选用硫酸铵、硫酸钠、磷酸钠作为成相盐并和PEG6000组成双水相萃取体系，盐和聚乙二醇的浓度分别为16％和6％，成相体系的pH值均为8.0；在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，计算病毒回收率，确定双水相萃取体系；
(2)第一步双水相萃取，在病毒悬液中加入2％的氯仿，并振荡10min；在4℃条件下，以8000rpm/min离心10min，弃沉淀，取上清，得到澄清的病毒液；在澄清病毒液中加入双水相萃取成相物质，但并不使溶液分相，用氨水将体系的pH值调整为8.0，振荡10min后，在4℃条件下，以8000rpm/min离心5min，弃沉淀，取上清，进一步澄清病毒液；
(3)第二步双水相萃取，在第一步双水相萃取体系中补加聚乙二醇使其终浓度达到6％，形成硫酸铵/聚乙二醇双水相体系，并加入0.5％的氯化钠，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，使双水相体系彻底分相，病毒进入中间相和上...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙普，杜平，卢曾军，马雪青，黄嘉馨，白兴文，李平花，付元芳，张婧，李坤，曹轶梅，包慧芳，李冬，刘在新，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62