本发明专利技术采用基因同源重组的方法缺失PRV人工致弱株FB的gE/gI基因，具备了可供鉴别诊断野毒感染的基因标记，适合目前通用的gE ELISA鉴别诊断试剂盒，以缺失株作为种毒制备的灭活疫苗可对PRV新发变异超强毒株FJ‑2012的攻毒产生完全的免疫保护作用；FB gE/gI基因缺失株与Bartha‑K61疫苗株相比具有更高的安全性，因此FB gE/gI基因缺失株也适合作为预防新发变异PRV超强毒株感染的弱毒活疫苗候选株。
【技术实现步骤摘要】
伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一株伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用。
技术介绍
伪狂犬病（Pseudorabies,PR），又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’sDisease,AD），是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。PRV感染许多哺乳动物，包括猪、牛、绵羊、山羊、狗、兔、野猪、貂、熊、猫、狐狸、鼠和野生小鼠，除过猪以外其余引起严重的神经症状和死亡。而猪是PRV感染后唯一可以存活的动物，因此也是该病毒的贮存宿主，并且是PRV唯一的储存库。该病给全世界生猪养殖业带来巨大的经济损失，但部分欧美国家对该病投入巨大的人力、物力及财力，通过gE-ELISA鉴别诊断技术已经在家猪净化和消灭了该病。多年来，我国普遍采用gE缺失的弱毒活苗免疫接种、野毒监测和净化等技术，该病也得到有效控制，其发病和流行情况趋于稳定，但是从2011年10月开始，我国大部分地区先后在Bartha-K61免疫的规模化猪场再次出现伪狂犬病暴发和流行，在2011年以后分离的变异PRV对于85日龄的育肥猪也具有致死性，给我国养猪业造成严重的经济损失，其主要特点为：(i)免疫过Bartha-K61疫苗的怀孕母猪发生高流产率；(ii)生长猪出现中枢神经系统紊乱并且高死亡率；(iii)血清高gE阳性率。PRV给世界各国生猪养殖业带来巨大困扰，特别是养猪量较大的国家，包括南美洲、欧洲和亚洲，但是通过大规模的使用gE缺失疫苗和DIVA（differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals,DIVA）鉴别诊断技术，美国和部分欧洲国家已经从家猪中根除了猪伪狂犬病，但在美国、德国等国家，PRV依然在野猪群中流行和传播。中国在1950s年代首次报道了伪狂犬病例，在1970s，Bartha-K61疫苗毒株被引进到中国，从1990s到2011使用Bartha-K61疫苗株或本地gE缺失弱毒苗使PR得到了很好的控制。然而从2011年10月开始，我国免疫了Bartha-K61疫苗的规模化猪场史无前例的大面积的暴发猪伪狂犬病，并且席卷全国，快速的传播到中国其他省市，对中国养猪业造成了毁灭性打击。研究表明，与经典的PRV毒株相比，从不同流行地区规模化猪场分离到的PRV毒株均表现出毒力增加，对育肥猪和仔猪的致病性增加，并且可以引起育肥猪中大猪的死亡，而且现有疫苗对新发变异毒株不能提供很好的保护，为新发变异的PRV超强毒株。2011年以后分离的所有新发变异超强PRV毒株，与欧洲和美洲毒株或2000年以前分离的中国传统株相比，在基因组序列上具有明显的变异。近年来从我国不同地区分离了大量的新发PRV毒株，包括HNX,ZJ01,HeN1,SMX,TJ,JS,HNB、HN1201、FJ-2012等。因此，在我国PRV的变异和毒力增强给我国现阶段的养猪业带来了严重的困扰。综上，开发可防控经典PRV和新发变异PRV感染的安全、有效，具备鉴别诊断的新疫苗是十分有必要的。本专利技术采用基因同源重组的方法缺失PRV人工致弱株FB的gE/gI基因，具备了可供鉴别诊断野毒感染的基因标记，适合目前通用的gEELISA鉴别诊断试剂盒，以缺失株作为种毒制备的灭活疫苗可对PRV新发变异超强毒株FJ-2012的攻毒产生完全的免疫保护作用；FBgE/gI基因缺失株与Bartha-K61疫苗株相比具有更高的安全性，因此FBgE/gI基因缺失株也适合作为预防新发变异PRV超强毒株感染的弱毒活疫苗候选株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建方法，包括以下步骤：（1）将FB株的gE/I缺失位置的上下游同源片段依次插入到质粒pUC19构建pUC19:H1:H2，再插入EGFP表达盒，构建同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:H2，再将BAC序列引入到pUC19:H1:EGFP:H2，形成可构建PRV人工染色体的同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2；（2）提取PRVFB毒株的感染性基因组DNA，与转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选含有荧光标记的gE/I基因缺失的重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+；（3）提取重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的感染性基因组，与转移质粒pUC19:H1:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC序列的无痕重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI。所述上下游同源片段H1和H2的序列如SEQIDNO.1-2所示，所述EGFP表达盒序列如SEQIDNO.3所示，所述BAC序列如SEQIDNO.4所示。步骤（2）所述重组病毒的构建方法包括以下步骤：（1）环状PRV基因组DNA的提取：1）将长满单层BHK-21细胞，接种PRV病毒，待出现30%细胞病变时，胰酶消化，离心，收集细胞；2）将收集的细胞400μLPBS重悬后，加入裂解液，混匀后消化过夜；3）加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液混匀，4℃下12000rpm离心10min；4）取上清液再次加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液混匀，4℃下12000rpm离心10min；5）重复4）一次；6）将上清液转移到新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇混匀，在-20℃沉淀过夜；7）4℃下12000rpm离心10min，弃上清，加入预冷的75%乙醇洗涤沉淀一次，7600rpm离心5min，弃上清，晾干，加30μLddH2O溶解DNA备用；（2）重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的构建、纯化与鉴定；在6孔板中将长至80%的BHK-21细胞用opti-MEM培养基洗涤2次，将转染液全部加入到洗涤好的细胞中，转染6小时后，换含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48-72小时，依细胞形态收集细胞及其培养液，冻融3次后，在6孔板中将收集的转然后病毒液全部接种1孔BHK-21细胞，培养24-48小时后，在荧光显微镜下观察是否产生荧光以及细胞病变；所述转染液配方包括：opti-MEM培养基2mL；lipofectamine®200010μL；PRVDNA10μL；pUC19:H1:EGFP:BAC:H220μL。进一步，利用上述方法制备获得伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株，所述毒株命名为伪狂犬病病毒FBΔgE/gI株，已于2020年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V202026。中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉，武汉大学。进一步，将上述缺失毒株应用于制本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株，其特征在于，所述毒株命名为伪狂犬病病毒FBΔgE/gI株，已于2020年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202026。/n
【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株，其特征在于，所述毒株命名为伪狂犬病病毒FBΔgE/gI株，已于2020年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V202026。
2.一种如权利要求1所述伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将FB株的gE/I缺失位置的上下游同源片段依次插入到质粒pUC19构建pUC19:H1:H2，再插入EGFP表达盒，构建同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:H2，再将BAC序列引入到pUC19:H1:EGFP:H2，形成可构建PRV人工染色体的同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2；
（2）提取PRVFB毒株的感染性基因组DNA，与转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选含有荧光标记的gE/I基因缺失的重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+；
（3）提取重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的感染性基因组，与转移质粒pUC19:H1:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC序列的无痕重组病毒rPRVFB-ΔgE/gI。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述上下游同源片段H1和H2的序列如SEQIDNO.1-2所示，所述EGFP表达盒序列如SEQIDNO.3所示，所述BAC序列如SEQIDNO.4所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述重组病毒的构建方法包括以下步骤：
（1）环状PRV基因组DNA的提取：
1）...
【专利技术属性】
技术研发人员：周伦江，侯博，王晨燕，刘玉涛，王隆柏，陈秋勇，吴学敏，陈少莺，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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