基于黑猩猩腺病毒载体的诺如病毒疫苗、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于黑猩猩腺病毒载体的诺如病毒疫苗、其制备方法及应用，该诺如病毒疫苗是通过将诺如病毒目的蛋白的核苷酸序列插入到重组黑猩猩腺病毒载体质粒上构建重组质粒后，再进行包装、加工获得的具有免疫原性的诺如病毒重组腺病毒疫苗。本发明专利技术首次基于黑猩猩腺病毒载体开发了诺如病毒疫苗，本发明专利技术的疫苗不会受人体中预存腺病毒抗体的影响；本发明专利技术中，腺病毒载体疫苗制备简单，安全性好，无需添加佐剂，可采用肌肉免疫或口服免疫等免疫途径；本发明专利技术以复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体为基础制备了诺如病毒预防性疫苗，有望获得制备简单、成本低廉、安全性好、无需添加佐剂、具有广泛的应用前景的疫苗产品。

Norovirus vaccine based on chimpanzee adenovirus vector, its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
基于黑猩猩腺病毒载体的诺如病毒疫苗、其制备方法及应用
本专利技术涉及疫苗
，特别涉及一种基于黑猩猩腺病毒载体的诺如病毒疫苗、其制备方法及应用。
技术介绍
诺如病毒（Norovirus），又称诺瓦克病毒（NorwalkViruses），是人类杯状病毒科（HumanCalicivirus）中的一种主要通过粪口途径传播的、具有高度传染性的病毒，也是引起群体中非细菌性胃肠炎间歇性爆发的主要病原体。诺如病毒在健康人群中无明显致病性，但在免疫缺陷病人、老人和小孩中可引起严重的疾病并可持续较长的时间。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行。在美国、荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家，在每年的非细菌性腹泻爆发中，60–90%是由诺如病毒引起。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒的检出率为15%左右，血清抗体水平的调查也表明中国人群中诺如病毒的感染十分普遍。目前仍没有针对诺如病毒的疫苗和特效药物。诺如病毒是单股正链RNA病毒，基因组大小约7.5kb，总共包含三个开放阅读框（ORF），其中ORF2编码诺如病毒最主要的结构蛋白VP1。其二十面体衣壳结构由90个VP1二聚体和少量VP2构成，VP1又包含两个结构域，S和P。其中，S结构域是基座，而P结构域则是细胞受体（Humanhistobloodgroupantigen，HBGA）的结合域，同时也是中和抗体的主要靶点。因此，目前诺如病毒预防性疫苗的开发主要以VP1蛋白或P结构域作为主要的抗原设计位点。研究表明，高滴度的抗GII.4HBGA阻断抗体和特异性IgA抗体水平以及免疫记忆性B细胞与诺如病毒的低风险致病性有关（AtmarR.L.,BernsteinD.I.,LyonG.M.,etal.(2015).SerologicalCorrelatesofProtectionagainstaGII.4Norovirus.ClinVaccineImmunol.22(8),923-9.）。因此，B细胞免疫原性是诺如病毒疫苗最主要的评价指标（AtmarR.L.,RamaniS.,andEstesM.K.(2018).Humannoroviruses:recentadvancesina50-yearhistory.CurrOpinInfectDis.31(5),422-432.）。由于缺乏小动物模型和病毒体外细胞培养系统，诺如病毒疫苗的研发困难重重，目前还没有诺如病毒疫苗上市。处于临床阶段的诺如病毒疫苗主要包括以VP1蛋白为基础构建的VLP疫苗（Leroux-RoelsG.,CramerJ.P.,MendelmanP.M.,etal.(2018).SafetyandImmunogenicityofDifferentFormulationsofNorovirusVaccineCandidateinHealthyAdults:ARandomized,Controlled,Double-BlindClinicalTrial.JInfectDis.217(4),597-607.），以及以腺病毒5型为载体开发的口服疫苗（KimL.,LiebowitzD.,LinK.,etal.(2018).Safetyandimmunogenicityofanoraltabletnorovirusvaccine,aphaseIrandomized,placebo-controlledtrial.JCIInsight.3(13).）。诺如病毒至少有六个基因群，并可细分为至少30个基因型，常见的有。GI.1型、GII.3型、GII.4型、GII.17型等。近十多年来，GII.4是诺如病毒最主要的流行性基因型，其中70–80%的爆发是由GII.4感染引起的，且主要流行于广大低收入的东南亚、南亚、非洲等地区，造成极大的经济负担（MansJ.(2019).NorovirusInfectionsandDiseaseinLower-MiddleandLow-IncomeCountries,1997(-)2018.Viruses.11(4).）。因此，亟需研发出针对诺如病毒预防性疫苗，其中GII.4型的疫苗尤为重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于黑猩猩腺病毒载体的诺如病毒疫苗、其制备方法及应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种诺如病毒疫苗，该疫苗是通过将诺如病毒目的蛋白的核苷酸序列插入到重组黑猩猩腺病毒载体质粒上构建重组质粒后，再进行包装、加工获得的具有免疫原性的诺如病毒重组腺病毒疫苗。本专利技术中，通过改造野生型黑猩猩腺病毒可构建复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体疫苗，具有以下优势：1）由于腺病毒感染细胞后，其基因组可进入细胞核，因此腺病毒载体携带的外源抗原可通过内源蛋白加工途径刺激机体产生较强的CD8+T细胞和抗体应答；2）改造后的复制缺陷型腺病毒具有很好的安全性；3）腺病毒基因组不整合到宿主基因组中，无遗传致癌性；4）腺病毒对多种类型的细胞具有侵染性，有利于抗原蛋白的表达和递呈；4）腺病毒载体可装载最大8kb的外源基因；5）腺病毒载体在体内表达外源基因的时效性更长；6）腺病毒的扩增纯化工艺成熟，可以获得较高滴度的病毒颗粒；7）黑猩猩腺病毒在人体中无针对载体的预存免疫的影响，有利于疫苗免疫效果的最大化。在一个优选例中，所述诺如病毒疫苗编码诺如病毒的VP1蛋白。在一个优选例中，所述诺如病毒为GI.1型、GII.3型、GII.4型、GII.17型中的一种或多种。该四种诺如病毒均编码诺如病毒的VP1蛋白。在进一步优选的一个优选例中，所述诺如病毒为GII.4型，诺如病毒GII.4型VP1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1，来源于GeneBank（AccessionNo.N95698.1），诺如病毒GII.4型VP1蛋白的DNA序列为SEQIDNO:2。在一个优选例中，重组黑猩猩腺病毒载体为复制缺陷型63型或复制缺陷型3型腺病毒。本专利技术还提供了一种诺如病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）将诺如病毒目的蛋白的核苷酸序列插入到重组黑猩猩腺病毒载体质粒上构建重组质粒；2）将重组质粒酶切线性化后，转染至腺病毒包装细胞中，然后培养至80%左右的细胞有明显的细胞病变；3）收集细胞，采用反复冻融的方式破碎细胞，离心收集上清液；4）将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞由贴壁变成悬浮状态；5）依照步骤3）和4）反复扩大培养至一定的体积，收集细胞，破碎后离心上清液；6）取上清液进行重组腺病毒的纯化，获得纯化的病毒液，该病毒液即为诺如病毒重组腺病毒疫苗原液。在一个优选例中，所述包装细胞是可支持复制缺陷型腺病毒增殖的贴壁细胞系或悬浮细胞系。在一个优选例中，所述腺病毒包装细胞为贴壁HEK293细胞系。在一个优选例中，所述腺病毒纯化方式选择氯化铯密度梯度离心法。在一个优选例中，所述的重组黑猩猩腺病毒载体质粒是通过将野生型黑猩猩腺病毒63或3型基因组序列中E1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诺如病毒疫苗，其特征在于，该疫苗是通过将诺如病毒目的蛋白的核苷酸序列插入到重组黑猩猩腺病毒载体质粒上构建重组质粒后，再进行包装、加工获得的具有免疫原性的诺如病毒重组腺病毒疫苗；/n所述诺如病毒疫苗编码诺如病毒的VP1蛋白；/n所述诺如病毒为GII.4型，诺如病毒GII.4型VP1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，诺如病毒GII.4型VP1蛋白的DNA序列为SEQ ID NO: 2。/n

【技术特征摘要】
1.一种诺如病毒疫苗，其特征在于，该疫苗是通过将诺如病毒目的蛋白的核苷酸序列插入到重组黑猩猩腺病毒载体质粒上构建重组质粒后，再进行包装、加工获得的具有免疫原性的诺如病毒重组腺病毒疫苗；
所述诺如病毒疫苗编码诺如病毒的VP1蛋白；
所述诺如病毒为GII.4型，诺如病毒GII.4型VP1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1，诺如病毒GII.4型VP1蛋白的DNA序列为SEQIDNO:2。


2.根据权利要求1所述的诺如病毒疫苗，其特征在于，重组黑猩猩腺病毒载体为复制缺陷型63型或复制缺陷型3型腺病毒。


3.根据权利要求2所述的诺如病毒疫苗，其特征在于，该诺如病毒疫苗的制备方法包括以下步骤：
1）将诺如病毒目的蛋白的核苷酸序列插入到重组黑猩猩腺病毒载体质粒上构建重组质粒；
2）将重组质粒酶切线性化后，转染至腺病毒包装细胞中，然后培养至80%的细胞有明显的细胞病变；
3）收集细胞，采用反复冻融的方式破碎细胞，离心收集上清液；
4）将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至细胞由贴壁变成悬浮状态；
5）依照步骤3）和4）反复扩大培养，收集细胞，破碎后离心上清液；
6）取上清液进行重组腺病毒的纯化，获得纯化的病毒液，该病毒液即为诺如病毒重组腺病毒疫苗原液。


4.根据权利要求3所述的诺如病毒疫苗，其特征在于，所述的重组黑猩猩腺病毒载体质粒是通过将野生型黑猩猩腺病毒63或3型基因组序列中E1、E3和E4区域经删除和/或替换的改造后，再将改造后的序列插入到转移载体质粒上构建得到。


5.根据权利要求4所述的诺如...

【专利技术属性】
技术研发人员：史力，侯永凡，张超，张玲莉，刘海涛，李军瑞，王紫琰，朱钱钧，周晨亮，田文莉，刘革，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32