一种复合佐剂系统及制备该佐剂的方法技术方案

本发明专利技术涉及一种包含磷酸铝佐剂及CpG佐剂的新佐剂系统及其制备方法。本发明专利技术的新型佐剂系统可具有良好的体液免疫和细胞免疫，为新型疫苗佐剂的开发及应用提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种复合佐剂系统及制备该佐剂的方法
本专利技术属于医药
，具体涉及一种包含磷酸铝佐剂及CpG的新佐剂系统。
技术介绍
近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，活载体疫苗、DNA疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但免疫原性弱，诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，应用佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答就显得尤为重要。铝盐佐剂成本低、使用方便，是生物制品生产中应用最广的一种佐剂，也是最早被美国食品药物监督管理局(FDA)批准用于人类疫苗的佐剂。目前常用的铝佐剂主要为氢氧化铝佐剂(aluminumhydroxideadjuvant)和磷酸铝佐剂(aluminumphosphate)两种。铝盐作为疫苗佐剂有很多优点，除了增强免疫应答，还具有非常坚实的安全性数据。但它虽然可以有效地诱导体液免疫应答，但是对细胞免疫无明显作用，难以诱导细胞免疫应答。由于氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂的等电点和化学物理结构不一样，和不同疫苗抗原的复配优势和吸附亲和率也不一样。有些抗原更适合氢氧化铝佐剂，有些抗原更适合磷酸铝佐剂。就磷酸铝佐剂家族内也以磷酸根的含量不同，而有相应的等电点不同。新型CpGODN佐剂是未来最具看点的疫苗佐剂技术之一，美国的Coley公司和美国Dynavax公司的含CpGODN佐剂的疫苗已分别进入三期临床和被批上是。CpGOND为非甲基化的短核苷酸(胞嘧啶和鸟嘌呤，CpG)为基序的寡脱氧核苷酸(ODN)短序列，是迄今发现的人和动物的强烈免疫刺激因子。CpGOND不仅可增强疫苗的体液免疫应答，尤其是可大大增强其细胞免疫应答，后者正是铝佐剂所达不到的。目前CpG是已被临床证明安全有效的新型佐剂，能够增强疫苗的免疫原性，提高免疫应答率，刺激机体形成更有效的免疫保护，是开发新型疫苗的良好佐剂选择之一。调研目前相关科研文献发现CpG与铝佐剂联用，大多为氢氧化铝佐剂而少有涉及磷酸铝佐剂。氢氧化铝佐剂以铝羟基形式存在的，是一种纤维状粒子，等电点一般在10~11左右，在中性pH的溶液中以带正电荷微米颗粒形式存在，可较好的吸附带负电荷的CpG以及带负电的抗原；磷酸铝佐剂是羟基磷酸铝复合物，为一种球形粒子的聚集体，商品化的磷酸铝佐剂的等电点多是4-5左右，在中性pH（pH6-7.4）的溶液中以带负电荷微米颗粒形式存在，不利于带负电荷的CpG的吸附。为了解决磷酸铝佐剂吸附率较差的问题，现有技术给出了一些解决方案，例如在中国专利CN106729702中，对现有磷酸铝佐剂配制工艺和后处理工艺进行了探索改良，以获得吸附能力和外观形态均良好的磷酸铝佐剂，制备得到的磷酸铝粒径可以有效的控制在7.5-15nm之间而等电点控制在4.0-6.0之间，可以实现磷酸铝佐剂表面电荷和粒径趋于稳定且pH值更加接近于人体体液pH值。含有佐剂的疫苗制剂均为佐剂吸附抗原性型疫苗（疫苗中的抗原吸附于佐剂上）。而由于佐剂的存在，一些疫苗质量检定项目的检测会受到干扰，甚至无法开展。因此，实际操作中既需要提供一种具有较好解吸附效果的佐剂系统，又需要将吸附于佐剂上的抗原通过一定方式游离下来用于检测和分析。例如，中国专利103471902A中给出了对包含磷酸铝佐剂的疫苗的解吸附方式，指出应以碱溶液将含有佐剂的疫苗溶解，再采用含金属络合剂的酸性化学试剂中和的方法。这种方法极易造成抗原的降解，缺乏可行性。而专利CN1572324A则对佐剂系统的吸附方式给出了改进，指出对于包含铝佐剂及CpG佐剂的佐剂系统，抗原应仅吸附在铝佐剂上，而不宜吸附在CpG佐剂上（免疫刺激剂），这样更有利于达到质量控制的要求。而事实上抗原是CpG的几百倍大小，理论上不存在抗原在CpG上吸附的任何可能。本专利技术提供了一种新的佐剂系统，包括磷酸铝佐剂以及CpG佐剂，该新佐剂系统通过仔细调节磷酸根和铝离子的比例而实现调节铝佐剂等电点，控制佐剂表面电荷，提高抗原和CpG吸附率.本专利技术还提供了一种优化的解吸方法，可以给出较高的抗原解吸附效率，为后续抗原的体外活性评价提供基础，具有良好的商业价值。
技术实现思路
本专利技术给出了一种包含磷酸铝佐剂的改良型佐剂系统。本专利技术的专利技术人出乎意料地发现，与传统商用选择不同，若选择等电点为7.0-9.0而非4.0-6.0左右的磷酸铝佐剂，将使得抗原和CpG佐剂能良好地吸附在磷酸铝佐剂上。本专利技术发现，通过将CpG佐剂和特殊选出的磷酸铝佐剂符合使用，获得的相应的符合佐剂系统，该佐剂系统具有较好的吸附抗原和CpG佐剂的能力，也同时允许抗原和CpG被有效地解吸附，获得抗原溶液，有利疫苗的制备,抗原含量及活性等评价。其中，本专利技术发现，当磷酸铝中铝元素和磷酸的比值升高时，CpG的吸附强度会线性增加，这是因为在相同的中性pH环境下，随着磷酸铝中铝元素和磷酸的比值升高，磷酸铝的等电点也在线性升高，导致磷酸铝的表面电荷阳性增强。另一方面，CpG和抗原的吸附都将随着铝佐剂含量（以佐剂中铝元素含量计算）升高而加强。本专利技术进一步聚焦在磷酸铝佐剂中铝元素含量及CpG含量之间的质量比在1:4-4:1之间时，发现CpG佐剂可以较好地吸附在磷酸铝佐剂上，同时抗原也具有较好的解吸附效果。更优选地，磷酸铝佐剂中铝元素及CpG之间的质量比在1:2-2:1之间时，CpG和抗原在磷酸铝佐剂上都达到了最佳吸附。本专利技术中所指出的CpG佐剂，是指含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的DNA片段。它能激活B细胞、NK、DC树突状等细胞，诱导释放IL-12、IFNr，从而诱导强Th1型应答和细胞免疫。作为举例，理想的CpG佐剂可以是CpG7909(Coley公司)或CpG1018ISS(Dynavax公司)等。本专利技术通过调节可溶性铝盐、可溶性磷酸盐与碱性溶液三者的比例，获得了一系列等电点大于商品化磷酸铝佐剂等电点（等电点为5.0）的磷酸铝佐剂。更优选地，本专利技术的专利技术人制备得的磷酸铝佐剂，等电点在7.0-9.0之间。优选地为8.0-9.0之间。最优选地，本专利技术的专利技术人制备得的磷酸铝佐剂，等电点在8.5-9.0之间。在此基础上，本专利技术的专利技术人给出了一种包含磷酸铝佐剂的复合型佐剂系统，本专利技术所提供的获得等电点在7.0-9.0之间磷酸铝佐剂的方法为：1)将可溶性铝盐（优选为AlCl3）、可溶性磷酸盐（NaH2PO4，Na2HPO4或Na3PO4）混合，制备得到溶液1，其中PO43-与Al3+之间摩尔比在1:3-1:10之间；2)将溶液1与碱溶液（优选为NaOH）混合，在预定pH条件下沉淀来制备磷酸铝佐剂，其中PO43-与Al3+之间的摩尔比在1:3-1:10之间;为保证衡定pH,在使用NaH2PO4的情况下，PO43-与OH-摩尔比在3:5.56-10:22.7之间.3)吸附抗原和CpG佐剂，形成本专利技术中的复合型佐剂系统的疫苗产品；或者将直接与带负电荷的CpG佐剂合用，形成复合佐剂系统。关于上述方法，另一种表述方式为：1.将可溶性铝盐、可溶性磷酸盐与不同浓度碱性溶液相混合，在；2.通过调节反应溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复合佐剂系统，其包含磷酸铝佐剂和CpG佐剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种复合佐剂系统，其包含磷酸铝佐剂和CpG佐剂。


2.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附疫苗抗原和CpG佐剂。


3.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附85-100%疫苗抗原和50-100%CpG佐剂。


4.如权利要求3所述的佐剂系统，其特征在于，所述佐剂系统中磷酸铝佐剂吸附85-100%疫苗抗原和80-100%CpG佐剂。


5.如权利要求2所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂与CpG之间的重量比为磷酸铝:CpG=1:4-4:1。


6.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂与CpG之间的重量比为1:2-2:1。


7.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂的等电点在7.0-9.0之间。


8.如权利要求1所述的佐剂系统，其特征在于，所述磷酸铝佐剂的等电点在8.0-9.0之间。

【专利技术属性】
技术研发人员：刁美君，魏健，史力，莫呈钧，张智，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32