幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗及制备方法与应用技术

本申请提供了幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗及制备方法与应用，属于生物医学及生物工程领域。本申请提供的幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗GEM‑SAM

Preparation and application of Ge granule vaccine of Helicobacter pylori

【技术实现步骤摘要】
幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗及制备方法与应用
本专利技术涉及生物医学及生物工程领域，具体而言，涉及幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗及制备方法与应用。
技术介绍
幽门螺旋杆菌（Hp）是胃炎、胃溃疡和胃癌的重要致病因子，世界感染率超过50%，我国Hp感染率高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性，形式更加严峻。目前，临床治疗Hp感染性胃病的方法主要是多联抗生素疗法，但是面临着抗生物导致Hp耐药性、治疗后再感染、抗生素破坏肠道微生态平衡、药物毒副作用和病人依从性差等问题，难以在Hp感染人群中大规模推广使用，研发有效的Hp疫苗具有很好的应用前景。Hp对人类胃部的感染，关键的第一步是通过黏附因子黏附胃黏膜细胞。口服类疫苗的免疫原性一般较弱，需使用大量抗原多次接种，且免疫应答持续时间较短，容易产生免疫耐受。微皱褶细胞（M细胞）是胃肠道黏膜免疫系统中一种特化的抗原转运细胞，散布于黏膜上皮细胞间，能将抗原从胃肠腔内转运到上皮下的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应。M细胞是胃肠道黏膜免疫系统的“入口”，其对抗原的摄取是启动胃肠黏膜免疫应答关键的第一步。因此，“抗原能否被M细胞大量摄取”是口服类疫苗免疫成败的关键所在。利用“与M细胞表面受体相结合的M细胞靶向肽”，将抗原靶向递呈给M细胞，增加其对抗原的摄取和转运效率，激发高水平黏膜免疫应答，是一种提高口服类疫苗免疫效果的有效策略。口服类疫苗在激发胃肠道黏膜免疫应答和特异性细胞免疫应答具有一定优势，但是直接口服给药，疫苗效果往往甚微，其中主要原因是：胃肠道中存在大量的酸和蛋白水解酶，会破坏疫苗抗原。因此，研究安全有效的黏膜免疫投递系统是口服类疫苗研究领域的一个热点。乳酸菌是一群在人体肠道内的常见益生细菌，作为口服类疫苗的黏膜免疫投递系统，具安全性高等独特优势。另外，将抗原展示在乳酸菌表面更符合黏膜疫苗的要求。锚定蛋白是细菌表面展示技术中的核心组件。N-乙酰胞壁质酶（AcmA）是在乳酸菌表面展示系统中常用的一种锚定蛋白。然而，在胞内表达的AcmA往往跨膜转运活性不强。基于AcmA设计更为有效的乳酸菌细胞表面展示系统，仍是一项亟待研究的工作。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，公开了幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗，其特征在于，在GEM颗粒表面展示有重组抗原SAME-FAdE；重组抗原SAME-FAdE含有核心组件SAME和幽门螺旋杆菌黏附因子多表位肽FAdE。幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗GEM-SAME-FAdE特点如下：（1）在GEM颗粒表面展示有重组抗原SAME-FAdE；重组抗原SAME-FAdE含有核心组件SAME和幽门螺旋杆菌黏附因子多表位肽FAdE。（2）GEM颗粒疫苗GEM-SAME-FAdE表面展示的重组抗原SAME-FAdE具有M细胞靶向的性质，可增加胃肠道M细胞对重组抗原SAME-FAdE的摄取量和转运效率，增强胃肠道黏膜特异性免疫应答。（3）GEM颗粒疫苗GEM-SAME-FAdE可激发机体产生针对幽门螺旋杆菌多种关键黏附因子的特异性黏膜免疫应答。GEM颗粒表面展示技术是一种基于革兰氏阳性增强基质颗粒（即GEM颗粒）的非活性、非遗传修饰的新型乳酸菌表面展示技术，称之为GEM颗粒表面展示技术，又叫细菌样颗粒表面展示技术。GEM颗粒表面展示技术主要利用热酸处理乳酸菌，去除蛋白质和核酸等大分子物质，制备仅含有细胞壁肽聚糖骨架的空心颗粒，叫GEM颗粒；将高纯度疫苗抗原与GEM颗粒混合，疫苗抗原通过与其偶联的锚定蛋白展示在GEM颗粒表面，制备的疫苗叫GEM颗粒疫苗，又叫细菌样颗粒疫苗。在前述的第一方面的一些实施例中，黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码黏附因子多表位肽FAdE的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。幽门螺旋杆菌的关键黏附因子主要有尿素酶、黏附素HpaA、外膜蛋白Lpp20、CagL等。目前国内外尚无上市可用的Hp疫苗，全菌疫苗或亚单位疫苗，存在毒副作用、免疫特异性不高、保护性较低等问题。表位疫苗是一种新型疫苗，较之传统疫苗具有高安全性、高特异性和设计灵活等优势，是发展Hp疫苗尤其治疗性Hp疫苗的新策略。Hp黏附因子多表位疫苗CFAdE含来自Hp四种关键黏附因子（尿素酶、Lpp20、HpaA和CagL）的多表位肽FAdE和霍乱毒素B亚基（CTB），研究已证实CFAdE具有很好的防治Hp感染的免疫效果。幽门螺旋杆菌黏附因子多表位肽FAdE是来自Hp黏附因子多表位疫苗CFAdE中除去CTB的多表位肽部分，主要包含来自Hp四种关键黏附因子尿素酶、Lpp20、HpaA和CagL的优势表位或表位区段，可刺激机体产生针对幽门螺旋杆菌关键黏附因子的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。在前述的第一方面的一些实施例中，核心组件SAME的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码核心组件SAME的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在前述的第一方面的一些实施例中，重组抗原SAME-FAdE的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；编码重组抗原SAME-FAdE的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本申请的第二方面，公开了幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌引起的疾病的药物中的应用。本申请的第三方面，幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：合成如序列SEQIDNO.4所示的SAME基因片段，将SAME基因片段通过酶切和连接，克隆到pCzn1载体上，得到peSAME重组载体；通过扩增得到如序列SEQIDNO.2所示的黏附因子多表位肽FAdE基因片段，双酶切所述FAdE片段和peSAME重组载体；将peSAME重组载体线性化片段与FAdE片段连接，得到peSAME-FAdE重组载体；将peSAME-FAdE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，纯化得到重组抗原SAME-FADE；通过三氯乙酸制备乳酸菌的GEM颗粒，将制备的GEM颗粒和重组抗原SAME-FAdE混合重悬，得到GEM颗粒疫苗GEM-SAME-FAdE。在前述第三方面的一些实施例中，诱导剂为IPTG，诱导剂的工作浓度为0.5mmol/L。在实施例中，通过IPTG的诱导，重组表达菌株能快速大量的表达重组抗原SAME-FAdE。在前述第三方面的一些实施例中，表达宿主细胞为大肠杆菌；优选地，大肠杆菌选自ArcticExpress(DE3)，DH5α，TOP10，BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS或Rosetta；进一步优选地，大肠杆菌为ArcticExpress(DE3)。在实施例中，蛋白表达的宿主细胞有多种，本实施例中优选大肠杆菌中的ArcticExpress(DE3)菌株进行表达。通过大肠杆菌的表达系统，能快速高效的表达出目的蛋白，提高重组蛋白的收率和质量。在前述第三方面的一些实施例中，纯化重组蛋白包括层析和透析；柱层析选用Ni-IDA-SepharoseCL-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗，其特征在于，在GEM颗粒表面展示有重组抗原SAM

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗，其特征在于，在GEM颗粒表面展示有重组抗原SAME-FAdE；重组抗原SAME-FAdE含有核心组件SAME和幽门螺旋杆菌黏附因子多表位肽FAdE。


2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗，其特征在于，所述黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；编码所述黏附因子多表位肽FAdE的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗，其特征在于，所述核心组件SAME的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码所述核心组件SAME的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗，其特征在于，重组抗原SAME-FAdE的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；重组抗原SAME-FAdE的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


5.如权利要求1-4任一项所述幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的药物中的应用。


6.幽门螺旋杆菌四价黏附因子GEM颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
合成如序列SEQIDNO.4所示的核心组件SAME基因片段，将所述SAME基因片段通过酶切和连接，克隆到pCzn1载体上，得到peSAME重组载体；
通过扩增得到如序列SEQIDNO.2所示的黏附因子多表位肽FAdE基因片段，双酶切所述FAdE片段和所述peSAME重组载体；将p...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭乐，刘昆梅，楚元奎，王淑娥，刘宏鹏，李元，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64