【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为治疗工具的精确糖缀合物本说明书涉及糖缀合物治疗工具。更具体地，本专利技术涉及与免疫原性和抗原性载体肽和蛋白质的游离巯基非随机偶联的碳水化合物抗原，以及使用例如光催化巯基-烯“点击化学”反应生产其的改进方法。还描述了作为抗原、免疫原、疫苗以及在诊断中的应用。本说明书涉及多个文件，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
免疫疗法的最终目标是以类似于感染或肿瘤进展过程中产生的方式触发免疫系统的先天性和适应性应答。先天性和适应性免疫应答之间的主要界面是抗原呈递细胞(APC)，尤其是树突状细胞(DC)。APC能够通过模式识别受体(PRR)(例如Toll样受体(TLR))识别微生物。在识别微生物表面决定簇或异常和非天然抗原后，APC经历成熟和激活，导致MHC分子从细胞内区室到细胞表面重新分布，分泌细胞因子和趋化因子。微生物或肿瘤及其相关的抗原标志物可以通过内吞途径被APC吞噬，通常在那里被降解。然后将通过蛋白质加工而释放的肽和共价连接的抗原展示在II类MHC分子上，并被CD4+T细胞识别，这些CD4+T细胞转而会在收到来自APC的共刺激信号后经历功能成熟，转变为不同的亚类，例如Th1或Th2细胞。Th1细胞导致显著的促炎反应，并分泌IFN-γ和TNF-α，而Th2细胞则分泌典型的细胞因子。尽管Th1细胞主要与细胞介导的应答有关，但这两种类型的Th细胞都支持B细胞产生抗体，进而影响抗体的同种型和功能。例如，IL-12和TNF-α与Th1细胞的分化和1型IgG亚类的产生有关，而IL-6和其它Th2细胞因子对2型IgG亚类(IgG1)的产生...
【技术保护点】
1.用于产生糖缀合物免疫原的方法，所述方法包括：/n(a)提供与末端烯烃共价连接的碳水化合物抗原(烯基碳水化合物抗原)，所述末端烯烃通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基；/n(b)提供具有一个或多个游离巯基的载体蛋白质；和/n(c)进行光催化巯基-烯反应，以使所述碳水化合物抗原直接缀合至所述载体蛋白质的所述一个或多个游离巯基处，从而产生糖缀合物免疫原，/n其中所述载体蛋白质在施用于受试者后具有免疫原性，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述碳水化合物抗原与所述载体蛋白质的缀合增加了所述碳水化合物抗原在施用于所述受试者后的免疫原性。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180323 US 62/647,1511.用于产生糖缀合物免疫原的方法，所述方法包括：
(a)提供与末端烯烃共价连接的碳水化合物抗原(烯基碳水化合物抗原)，所述末端烯烃通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基；
(b)提供具有一个或多个游离巯基的载体蛋白质；和
(c)进行光催化巯基-烯反应，以使所述碳水化合物抗原直接缀合至所述载体蛋白质的所述一个或多个游离巯基处，从而产生糖缀合物免疫原，
其中所述载体蛋白质在施用于受试者后具有免疫原性，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述碳水化合物抗原与所述载体蛋白质的缀合增加了所述碳水化合物抗原在施用于所述受试者后的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述烯基碳水化合物抗原是水溶性的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在避免载体蛋白质变性和/或保留载体蛋白质的活性、抗原性和/或结构的反应条件下进行。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在不存在任何有机溶剂的情况下进行，或其中所述光催化巯基-烯反应在浓度足够低以避免载体蛋白质变性的有机溶剂的存在下进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在催化剂的存在下进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述催化剂是：
(a)水溶性催化剂，例如水溶性自由基生成偶氮化合物；2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(Vazo44或VA-044)；2,2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)；具有光引发活性的金属或金属离子；过氧化物；叔丁基过氧化氢；过氧化苯甲酰；过硫酸铵；或其具有光引发活性的任何衍生物；或
(b)水不溶性催化剂，例如水不溶性自由基生成偶氮化合物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、2,2′-偶氮双(2-甲基丙腈)、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)、1,1'-偶氮双(氰基环己烷)(ACHN)、二氮烯二羧酸双(N,N-二甲基酰胺)(TMAD)；偶氮二羧酸二胡椒脂(ADD)或其具有光引发活性的任何衍生物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在短波紫外光下的辐照。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在约254nm处的辐照。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在长波紫外光下的辐照。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在约355nm或365nm处的辐照。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括所述载体蛋白质的每个游离巯基与1至200摩尔当量的所述烯基碳水化合物抗原反应；和/或其中所述光催化巯基-烯反应进行10至300、10至270、10至240，10至210、10至180、10至150、10至120、10至90、10至60、或10至30分钟，和/或持续足够的时间以实现所述载体蛋白质中的总游离巯基浓度降低至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0至约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH下和/或在避免载体蛋白质变性的pH下进行。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在与所述载体蛋白质缀合之后，所述碳水化合物抗原不能被所述受试者的内源酶从所述载体蛋白质上切割。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述烯基碳水化合物抗原与所述末端烯烃共价连接，和/或所述碳水化合物抗原通过糖苷键例如O-糖苷键、S-糖苷键、N-糖苷键或C-糖苷键或通过例如烯丙基胺和还原糖之间的还原胺化获得的键与所述载体蛋白质缀合。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物抗原包含B细胞表位，和/或在所述受试者中诱导体液免疫应答；和/或包含T细胞表位，和/或在所述受试者中诱导细胞介导的免疫应答。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物抗原是或包含肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述TACA是、来自或包含：Tn、S-Tn、Thomsen-Friedenreich(TF)、(2,3)-S-TF、(2,6)-S-TF、GloboH、GD2、GD3、GM2、GM3、N-乙醇酰-GM3、Lea、sLea、Lex、sLex或其任何组合。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应将至少两个相同碳水化合物抗原或超过一种类型的碳水化合物抗原缀合至所述载体蛋白质，从而产生多价糖缀合物免疫原。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述多价糖缀合物免疫原包含与所述载体蛋白质缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个相同或不同类型的碳水化合物抗原。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物抗原是或包含病毒多糖抗原或细菌荚膜多糖(CPS)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌CPS是、来自或包含肺炎球菌的和/或链球菌的多糖血清型、脑膜炎球菌CPS或流感(例如a或b型流感)CPS。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中(a)中的所述碳水化合物抗原通过接头与所述末端烯烃连接。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质包含具有一个或多个游离巯基的一个或多个半胱氨酸残基，或任选地被工程化改造以添加一个或多个另外的半胱氨酸残基，例如在所述载体蛋白质的氨基末端、羧基末端或溶剂可及位置。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质包含人T细胞表位，和/或在所述受试者中诱导细胞介导的免疫应答。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质是、来自或包含：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应材料197(CRM197)、脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌D蛋白(HiD)、细胞因子、免疫原性肽例如破伤风毒素831-844(SEQIDNO:1或2)、白蛋白(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)，或其免疫原性片段。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中：
(i)在进行所述光催化巯基-烯反应之前或与之一起，用还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙胺-HCl或2-巯基乙醇预处理所述载体蛋白质；
(ii)在进行所述光催化巯基-烯反应之前或与之一起，用巯基化剂例如2-亚氨基硫杂环戊烷或N-羟基琥珀酰亚胺二硫代丙酸酯(DPS)预处理所述载体蛋白质；
(iii)在进行所述光催化巯基-烯反应之前或与之一起，用巯基化剂例如2-亚氨基硫杂环戊烷或N-羟基琥珀酰亚胺二硫代丙酸酯(DPS)预处理并且然后用还原剂预处理所述载体蛋白质；
(iv)所述载体蛋白质是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中在所述光催化巯基-烯反应之后，所述一个或多个二硫键保持不受影响；
(v)所述载体蛋白质是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中用还原剂预处理所述载体蛋白质以暴露一个或多个另外的游离巯基以用于与所述碳水化合物抗原缀合；或
(iv)所述载体蛋白质是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中用巯基化剂(2-亚氨基硫杂环戊烷或N-羟基琥珀酰亚胺二硫代丙酸酯(DPS))预处理所述载体蛋白质以暴露一个或多个另外的游离巯基以用于与所述碳水化合物抗原缀合，并且随后用还原剂预处理。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于缀合之前所述载体蛋白质上可用的游离巯基的数目。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述糖缀合物免疫原在施用于所述受试者后诱导针对所述碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，进一步包括：(d)纯化所述糖缀合物免疫原。
30.用于产生糖缀合物疫苗或触发适应性免疫应答的组合物的方法，所述方法包括将通过权利要求1至29中任一项所述的方法制备的糖缀合物免疫原与药学上可接受的赋形剂和/或佐剂一起配制。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述佐剂是或包含：无机化合物、矿物油、微生物衍生物、植物衍生物、细胞因子、角鲨烯、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物、toll样受体激动剂、免疫刺激性多核苷酸(例如CPG)、免疫刺激性脂质、弗氏佐剂、RIBI佐剂、QS-21、胞壁酰二肽、TiterMax、Steviune、Stimune或其任何组合。
32.合成糖缀合物免疫原，包含一个或多个碳水化合物抗原和具有一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基的免疫原性载体蛋白质，其中所述一个或多个碳水化合物抗原连接在所述免疫原性载体蛋白质的所述一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基处，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述一个或多个碳水化合物抗原与所述免疫原性载体蛋白质的缀合增加了所述一个或多个碳水化合物抗原在施用于受试者后的免疫原性。
33.根据权利要求32所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述一个或多个碳水化合物抗原通过接头与所述一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基连接。
34.根据权利要求32所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述一个或多个碳水化合物抗原通过如权利要求13或14中所限定的键与所述接头连接。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述一个或多个碳水化合物抗原如权利要求2、15、16、17、20或21中所限定。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，所述合成糖缀合物免疫原是如权利要求18或19中所限定的多价糖缀合物免疫原。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述载体蛋白质如权利要求23、24、25或26中所限定义。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于所述载体蛋白质上溶剂可及的半胱氨酸残基的数目。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，所述合成糖缀合物免疫原在施用于所述受试者后诱导...
【专利技术属性】
技术研发人员：切·赫·希奥，勒内·罗伊，
申请(专利权)人：科纳克斯资本，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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