本发明专利技术公开了一种用于猪流行性腹泻的病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗技术领域。所述抗原抗体复合物疫苗由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h获得。本发明专利技术抗原抗体复合物疫苗无需对抗原进行灭活，可使其中的活病毒得到有效保护，从而诱导免疫器官产生更多的免疫生发中心。复合物疫苗中抗体起着延缓病毒释放的作用，其中抗体的Fc片段使复合物更易被抗原提呈细胞捕获，从而引起免疫应答。本发明专利技术的病毒抗原抗体复合物疫苗既能突破母源抗体又能诱导高效价抗体，对哺乳仔猪、后备猪、母猪及其后代仔猪均具有良好的免疫效果和攻毒保护率。
【技术实现步骤摘要】
一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法
本专利技术属于兽用疫苗
，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法。技术背景猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)是一种能够引起猪的急性肠道传染病。感染猪主要症状为剧烈腹泻、呕吐和脱水；该病毒只感染猪，各种年龄和品种的猪均易感。PEDV的感染方式主要是通过被感染猪的粪便等经由消化道感染，其中受到的危害最严重的是哺乳仔猪，其发病死亡率高达80～100%，该病毒感染是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。我国最早在1976年首次报道该病的出现，在2010以后在我国多个省份爆发PEDV的感染，给我国的生猪养殖产业造成了巨大的经济损失。目前生产上对于PEDV的防控，主要是采用传统疫苗，包括组织灭活苗、细胞灭活苗及弱毒疫苗，这些疫苗在PEDV的防治中起着重要的作用，传统疫苗均是免疫母猪从而使哺乳期仔猪获得先天免疫或通过采食初乳获得被动性免疫，但由于疫苗接种不当或母猪的健康状况不良等因素致使疫苗接种后的母猪不能产生足够的保护性抗体，无法给仔猪提供足以抵御病毒感染的免疫力，并且由于仔猪在整个哺乳期均面临PEDV感染的风险，而随着母源抗体的消失和开食后母乳摄入的减少，形成了仔猪免疫的空白期，增加了PEDV感染的风险。抗原抗体复合物疫苗又称免疫复合物疫苗，是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照恰当的比例与抗原混合而成，其优点包括可以突破母源抗体干扰,产生主动免疫，抗原抗体复合物疫苗中的抗体主要作用是延缓病毒的释放。病毒与抗体形成复合物以后,由于抗体分子的Fc片段与抗原提呈细胞（APC）的Fc受体有很高的亲合性,因而使得与抗体结合的病毒更易更有效地与APC结合，从而激活B淋巴细胞和T淋巴细胞,刺激B淋巴细胞成为抗体分泌细胞，诱导机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。并且在与其他疫苗同时接种时，不影响其他疫苗的免疫效果。基于以上优点近年来在动物疫病防控中的作用越来越受到关注。
技术实现思路
为了解决传统疫苗不适用于仔猪免疫从而造成仔猪在哺乳期的免疫保护不足，感染PEDV的风险增加的问题，本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法。一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗，由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h制得；所述猪流行性腹泻病毒抗原是将猪流行性腹泻临床病料的毒株接种vero细胞培养，传代至40～45代，所得到细胞半数感染量（TCID50）为10-5/mL～10-6/mL的猪流行性腹泻病毒即为病毒抗原液；所述猪流行性腹泻病毒抗体是将配制的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗通过对实验猪的加强免疫，获得实验猪的血清抗体，抗体效价不低于1:128的血清抗体即为病毒抗体；所述猪流行性腹泻临床病料的毒株已于2019年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心保存，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:V201915。一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗的制备操作步骤如下：（1）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗原液将浓度104/mL的vero细胞液接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入6mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气培养2～3天；显微镜观察，当细胞铺满至90%时,用D-Hanks缓冲液清洗细胞面2次；将1mL种毒液接种于25cm2的细胞培养瓶，加入终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，混合均匀，在温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气孵育2h，每30分钟轻摇培养瓶1次；孵育完成，用D-Hanks缓冲液清洗细胞面1次，加入5mL无血清细胞培养液和终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，继续培养3-4天；所述猪流行性腹泻临床病料的毒株以种毒液形式保藏于中国典型培养物保藏中心；当细胞培养物出现明显的细胞核增大、细胞皱缩、脱落和溶解时，收集细胞和培养液，反复冻融3次，转速5000r/min条件下离心5min，取上清液；至此病毒完成1次传代,接着重复上述传代操作，传代次数在40～45次；对上清液进行测定TCID50，满足TCID50为10-5/mL～10-6/mL的病毒液即为病毒抗原液；（2）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗体在病毒抗原液中加入终浓度为5mmol/L的二乙烯亚胺（BEI），灭活24h；使用10kd超滤管进行20倍浓缩，在浓缩液中按浓缩液总量25%的量加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀，即得到猪流行性腹泻病毒的灭活疫苗；采用所述灭活疫苗对60kg体重的实验猪进行三次免疫接种，在最后一次加强免疫接种后的第7天，采集实验猪血液；将实验猪血液在转速5000r/min条件下离心10min，取血清，在温度56℃的水浴条件下灭活30min，-20℃保存；采用琼脂扩散实验测定血清抗体效价，血清抗体效价不低于1:128的高免血清即为病毒抗体；（3）制备抗原抗体复合物将所述病毒抗原液和所述病毒抗体按体积比1：5充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h，获得抗原抗体复合物，按抗原抗体复合物总量0.005%的量加入浓度10%的硫柳汞溶液，充分混合即为抗原抗体复合物疫苗。进一步限定制备方法的技术方案如下：步骤（2）中，所述实验猪为清洁级实验猪，不携带所规定的重要人兽共患病病原、猪烈性传染病病原以及不携带所规定的对猪危害大和对科学研究干扰大的病原的实验用猪。步骤（2）中，实验猪的具体免疫操作如下：灭活疫苗免疫采用后海穴注射接种，进行3次接种；第一次接种剂量为4mL/只，在第一次接种后的第14天和第28天分别加强免疫接种一次，接种剂量均为5mL/只。将所述抗原抗体复合物疫苗通过0.22um的滤膜过滤除菌，并分装于50mL灭菌玻璃瓶中，置于4℃保存。本专利技术的有益技术效果体现在以下方面：（1）本专利技术采用临床分离猪流行性腹泻病毒致病毒株，该病毒株的毒力较强，但是就疫苗的效果来说，毒力越强的毒株免疫原性越好，越能够刺激机体产生主动免疫；由于毒力强采用强毒株制作的疫苗一般是灭活疫苗，但灭活疫苗液存在免疫反应持续时间较短，需要多次接种、诱导的免疫反应水平较低，以及灭活疫苗中存在灭活剂对病毒抗原存在影响等缺点。本专利技术抗原抗体复合物疫苗无需对病毒抗原进行灭活，不破坏病毒抗原的完整性，抗原抗体复合物可使其中的活病毒得到有效保护，从而诱导器官产生更多的免疫生发中心。抗原抗体复合物中的抗体可Fc片段更易与抗原递呈细胞(APC)结合，有效地激活淋巴T细胞,释放细胞因子。对40日仔猪分别进行灭活疫苗和本专利技术复合物疫苗进行3次免疫接种试验，分别在每次接种后的第7天采血，测定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗，其特征在于：由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h制得；/n所述猪流行性腹泻病毒抗原是将猪流行性腹泻临床病料的毒株接种vero细胞培养，传代至40～45代，所得到细胞半数感染量（TCID
【技术特征摘要】
1.一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗，其特征在于：由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h制得；
所述猪流行性腹泻病毒抗原是将猪流行性腹泻临床病料的毒株接种vero细胞培养，传代至40～45代，所得到细胞半数感染量（TCID50）为10-5/mL～10-6/mL的猪流行性腹泻病毒即为病毒抗原液；
所述猪流行性腹泻病毒抗体是将配制的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗通过对实验猪的加强免疫，获得实验猪的血清抗体，抗体效价不低于1:128的血清抗体即为病毒抗体；
所述猪流行性腹泻临床病料的毒株已于2019年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心保存，保藏编号为CCTCCV201915。
2.根据权利要求1所述的一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗原液
（1.1）将浓度104/mL的vero细胞接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入6mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气培养2～3天；显微镜观察，当细胞铺满至90%时,用D-Hanks缓冲液清洗细胞面2次；
（1.2）将1mL种毒液接种于25cm2的细胞培养瓶，加入终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，混合均匀，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气孵育2h，每30分钟轻摇培养瓶1次；
（1.3）孵育完成，用D-Hanks缓冲液清洗细胞面1次，加入5mL无血清细胞培养液和终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，继续培养3-4天；
所述猪流行性腹泻临床病料的毒株以种毒液形式保藏于中国典型培养物保藏中心；
当细胞培养物出现明显的细胞核增大、细胞皱缩、脱落和溶解时，收集细胞和培养液，反复冻融3次，转速5000r/min条件下离...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈学怀，潘孝成，刘华，赵瑞宏，张丹俊，翟银建，戴银，胡晓苗，周学利，侯红艳，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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