阳离子表位疫苗的制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种自组装纳米表位疫苗及其应用，通过对T细胞表位肽进行阳离子化修饰，使其与阴离子佐剂通过静电作用，并于水溶液中自组装形成纳米复合疫苗。所述疫苗能够预防或治疗肿瘤或作为抗癌活性制剂的联用制剂。本发明专利技术的表位疫苗具有组分明确、易制备、特异性腔、安全性高，具有良好的临床转化及实际应用前景。解决了合成疫苗合成效率低、分离纯化困难等问题。与其他疫苗相比，本发明专利技术表位疫苗制备方法简单，形成的疫苗纳米颗粒尺寸有利，不需要额外递送载体，实现抗原与佐剂的自递送，促进抗原呈递细胞活化，诱导抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长，能够实现肿瘤预防和治疗的功能。

【技术实现步骤摘要】
阳离子表位疫苗的制备及应用
本专利技术属于生物医学工程领域，特别涉及阳离子化抗原表位肽与阴离子佐剂自组装形成阳离子表位疫苗。
技术介绍
表位肽疫苗是一种基于抗原表位制备的新型疫苗，相比于传统疫苗，表位肽疫苗安全、无毒、稳定，并且成本低、特异性高、免疫类型具有可调控性，具有很高的研究和临床应用价值。表位肽疫苗直接递送抗原中最有效的信息片段—抗原表位，省去了复杂且低效率的抗原加工过程，可以直接与MHC分子结合呈递抗原信息，可以诱导更加有效且特异性更高的免疫反应。但是表位疫苗体内易降解导致免疫原性低，且化学合成疫苗合成效率低、分离纯化困难。为了解决上述问题，科研工作者往往会在设计化学合成疫苗的时候，引入其他佐剂联合应用，例如：CpG、PolyI:C、铝佐剂和MF59等，或者引入递送系统如：脂质体、水凝胶、支架等。但是，大量佐剂的添加会诱发机体炎症、自身免疫性疾病；而额外递送系统的加入往往会给表位疫苗的应用带来难以预测的毒副作用，如炎症反应、T细胞失活等，给临床应用产生极大的阻碍。另外，在这些疫苗中抗原与佐剂是简单的物理混合，没有相互作用。在抗肿瘤免疫治疗领域，纳米技术的应用也越来越成为人们关注的焦点。由于纳米制剂的自身特性及淋巴器官的结构特点，纳米粒子容易集中于淋巴结、脾脏等淋巴器官中；经过精心构建的纳米制剂具有良好的靶向性，可以将免疫激活类药物有效精准地递送给DC细胞、T细胞等特定的免疫细胞，在肿瘤相关免疫应答的各个环节发挥作用；纳米粒子可同时负载多种不同药物，在同一时空发挥作用，且具有药物缓释、控释功能，在肿瘤抗原提呈、免疫细胞活化过程中具有其他技术无法替代的优势，因此纳米技术在抗肿瘤疫苗中具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术一种阳离子表位疫苗，通过采取抗原表位肽阳离子修饰和自组装策略，利用静电作用进行组装，在抗原表位肽上引入细胞穿膜肽，使其变为正电性；选择CpG作为运载体系，一方面CpG自身带负电，可以与其通过静电作用自组装成纳米溶液，另一方面CpG自身可以作为免疫佐剂组分，增强免疫反应。本专利技术提供进行阳离子修饰过的抗原表位肽在制备治疗/预防肿瘤自组装表位疫苗的应用，它制备方法包括以下步骤：本专利技术提供进行阳离子修饰过的抗原表位肽在制备治疗/预防肿瘤自组装表位疫苗的应用，它制备方法包括以下步骤：步骤一，T细胞表位或B细胞表位的表位肽以共价键的方式与多聚精氨酸R8基团通过固相合成法连接，形成呈正电性的多肽序列；步骤二，由接有多聚精氨酸R8基团的含有抗原表位的多肽序列与阴离子佐剂CpG共同溶解在水溶液中，调整摩尔浓度，基于静电作用，并通过自组装形成呈正电性的纳米复合物。进一步地，阳离子化的表位肽为MHCI限制性CD8+T细胞表位肽进一步地，选用多聚精氨酸(R8)作为抗原表位肽的修饰物。进一步地，含有不同抗原表位的多肽序列与阴离子佐剂混合进行自组装，其摩尔比为10～60:1。进一步地，阳离子表位疫苗的粒径大小为10～2000nm。进一步地，阳离子表位疫苗可诱导DC活化及抗原表位交叉呈递。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术的阳离子表位疫苗是由阳离子表位肽与阴离子佐剂如CpG，通过静电作用并溶于水溶液形成的纳米复合物，组份明确，特异性更强，共递送表位肽和佐剂进入树突状细胞，有效地促进树突状细胞成熟活化，提高抗原表位肽交叉呈递。2.阴离子佐剂即可被用来作为纳米粒子用于疫苗的运输，不需要额外的递送载体(如：脂质体)，排除了递送载体不可预测的毒副作用，提高安全性和疫苗制备的简便性。3.不依赖抗原表位本身物化特性，几乎适用于所有短肽，可以针对不同癌症、不同抗原制备个性化表位疫苗。4.本专利技术的纳米粒子可以通过调节体系中的pH值来控制纳米粒子的直径大小。5.本专利技术的表位疫苗能够体外诱导骨髓来源的树突状细胞成熟活化，促进抗原表位以多肽/MHCI复合物形式呈递，诱导CD8+T细胞活化，特异性杀伤肿瘤细胞。6.本专利技术的表位疫苗具有良好的生物相容性，没有明显的毒副作用。7.本专利技术的表位疫苗能够诱导记忆性免疫系统构建，特异性应答肿瘤细胞，抑制肿瘤发生和生长。8.本专利技术的表位纳米疫苗诱导CD8+T淋巴细胞浸润肿瘤组织，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。附图说明图1为本专利技术制备表位疫苗的简易流程图图2阳离子化表位多肽的结构图3为本专利技术肽/CpG纳米复合物的DLS曲线与TEM图片图4为本专利技术不同表位肽/CpG质量比的纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳图图5为本专利技术表位疫苗体外刺激骨髓来源树突状细胞成熟活化效果示意图图6为本专利技术表位疫苗肿瘤治疗效果图图7为本专利技术表位疫苗诱导的肿瘤浸润性CD8+T细胞具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及特点更加清楚，以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述，但实施例的描述不对本专利技术的保护产生任何限制；所用的设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。实施例1：阳离子化表位多肽的制备本专利技术中所述表位肽为长度为5～20个氨基酸抗原表位包括T细胞或B细胞表位多肽，具体包括但不限于LWVFFDYVS,RWPSCQKKF,SIINFEKL,SVYDFFVWL,LCPGNKYEM,QAVHAAHAEINE,CYTWNQMNL,YMLDLQPETT,KSPWFTTL,SPSYVYHQF,EQLESIINFEKLTE,YEEYYPLI,EADPTGHSY,KIWEELSML,IMDQVPFSV,YMDGTMSQV,AAGIGILTV以及FLWGPRALI。本专利技术中所述细胞穿膜肽,包括但不限于RRRRRRRR,RRRRRRRRR,RRRRRRRRRR,RRRRRRRRRRRR,RKKRRQRRR,LLIILRRRIRKQAHAHSK,GRKKRRQRRRPPQ,RKKRRRESRKKRRRES,KKKKKKKK,SQIKIWFQNKRAKIKK,GRPRESGKKRKRKRLKP,TRQARRNRRRRWRERQR,RRRRNRTRRNRRRVR,RKKRRRESRRARRSPRHL,SRRARRSPRHLGSG,GKRKKKGKLGKKRPRSR,SRRARRSPRESGKKRKRKR,LRRERQSRLRRERQSR,RCGRASRCRVRWMRRRRI。以SVYDFFVWL、LCPGNKYEM、SIINFEKL作为抗原表位多肽，通过标准多肽固相合成法，制备接有多聚精氨酸R8基团的抗原表位多肽，即为阳离子化的抗原表位多肽序列。以SIINFEKL为例，进行抗原表位多肽的阳离子化。本专利技术中所有多肽的合成均使用的王树脂作为固相负载体，全部应用Fmoc固相合成方法。固相负载体在进行耦合氨基酸步骤之前，首先在二氯甲烷(DCM)溶液中溶胀30min，使其自然舒展开，可提高耦合氨基酸的效率。本专利技术使用的固相合成多肽的方法，每个氨基酸的耦合都可按照以下四个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阳离子表位疫苗，其特征在于：由阳离子化抗原表位肽与阴离子佐剂通过非共价键静电相互作用连接，并于水溶液中自组装形成阳离子表位疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种阳离子表位疫苗，其特征在于：由阳离子化抗原表位肽与阴离子佐剂通过非共价键静电相互作用连接，并于水溶液中自组装形成阳离子表位疫苗。


2.根据权利要求1所述阳离子表位疫苗，其特征在于：所述阳离子化的表位肽为MHCI限制性CD8+T细胞表位肽。


3.根据权利要求1所述阳离子表位疫苗，其特征在于：所述阴离子佐剂为CpG。


4.根据权利要求1所述阳离子表位疫苗，其特征在于：所述阳离子化抗原表位肽是由抗原表位肽以共价键的方式连接细胞穿膜肽形成。


5.根据权利要求4所述阳离子表位疫苗，其特征在于：所述细胞穿膜肽为多聚精氨酸。


6.一种阳离子表位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)筛选肿瘤高表达的抗原表位肽；
(2)通过Fmoc固相合成法得到修饰有...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟伟，时圣彬，宋会娟，黄平升，张闯年，时小光，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，山东第一医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：天津;12