胸腺肽Tα-1的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种胸腺肽Tα‑1的合成方法，包括以下步骤：1)按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸至固相载体上，合成侧链带保护基的5肽树脂；2)制备带Hmb保护基的7肽树脂；3)按照Fmoc固相合成方法继续偶联1～21位的残基，得到28肽树脂；4)28肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到Tα‑l粗肽。本发明专利技术通过在23位Val引入Hmb保护基，可以有效减少肽链偶联过程中的β折叠，进而提高反应效率，只有选择在23位Val引入Hmb保护基，既节约了生产成本，又对改善β折叠有非常明显的效果，提高了产品的总收率和纯度；本发明专利技术方法制得的Tαl粗肽的HPLC纯度可以达到98％，只有很少量杂质，相对于现有技术，大大简化了后续纯化的难度，节约了纯化成本，有利于产业化应用。

【技术实现步骤摘要】
胸腺肽Tα-1的合成方法
本专利技术属于制药领域，具体涉及一种未乙酰化的胸腺法新的合成。
技术介绍
胸腺中包含多种激素，归属于α、β、γ三类，共同诱导T细胞的成熟分化。胸腺肽主要活性成份是由28个氨基酸组成的胸腺肽α1(Tα1)，化学合成的商品为N端乙酰化的胸腺肽α1(Tα1)——胸腺法新。其分子量为3108.28，分子式为C129H215N33O55，肽序列为N-Acetyl-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH。在临床上经常将Tαl作为免疫增强剂或免疫调节剂用于各种免疫缺陷病和免疫受抑制疾病的治疗。目前胸腺法新的合成方法主要采用Fmoc固相合成。由于胸腺法新是困难多肽，在合成过程中形成β折叠，导致合成困难。β-折叠的结构中，主链两侧存在大量的氢键。这些氢键可使肽链紧紧的聚集在一起。当β-折叠结构在整个主链中占得比例越大时，该肽的溶解性就越差。这种特征会造成接肽反应困难。且采用传统的Fmoc固相顺序偶联方法，纯度只能达到约50％，即使采用多肽片段原料进行偶联如专利CN201410333844，纯度也只有62～66％。较低的纯度会使产率降低和纯化困难，进而导致生产成本上升。研究发现，骨架保护基能够打乱肽链的氢键，从而破坏β-折叠，进而改善肽的溶解性。但Dmb和Hmb等低活性骨架保护基的引入会使后续一个残基的偶联变得困难，特别是位阻较大的氨基酸，如缬氨酸Val，因此骨架保护基存在位点的限制。而高活性的Hmsb和Hnb等骨架保护基又涉及脱除步骤繁琐，以及各种副反应的发生，致使合成产物纯度并不高。鉴于上述情况，本专利技术采用Fmoc固相合成，在23位Val引入骨架N修饰保护基Hmb，如此，合成的28肽粗肽得到了难得的98％纯度。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中所提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种胸腺肽Tα-1的合成方法。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种胸腺肽Tα-1的合成方法，包括以下步骤：1)按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸至固相载体上，合成侧链带保护基的5肽树脂：NH2-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-β-Asp(OtBu)-氨基树脂；2)制备带Hmb保护基的7肽树脂：NH2-Val-(Hmb)Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-β-Asp(OtBu)-氨基树脂；3)按照Fmoc固相合成方法继续偶联1～21位的残基，得到28肽树脂：NH2-Ser(tBu)-Asp-(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-(Hmb)Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-β-Asp(OtBu)-氨基树脂；4)28肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到Tα-l粗肽。进一步地，1)中5肽树脂的制备具体包括以下步骤：a、将固相载体加入到固相合成反应器中用溶剂充分溶胀，然后用20％的哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基后洗涤；b、将Fmoc-Asp-OtBu和偶联剂加入到DMF中反应一段时间后，加入到固相合成反应器中，鼓氮气反应一段时间后洗涤；然后用20％的哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基后洗涤；重复上述过程，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。进一步地，2)中带Hmb保护基的7肽树脂通过如下方法制备：采用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Val-OH为原料引入，按照与1)相同的偶联方法将Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Val-OH偶联至1)所得到的5肽树脂后，脱除Fmoc保护基后通过对称酸酐法偶联22位Val，得到7肽树脂。进一步地，2)中带Hmb保护基的7肽树脂可通过如下方法制备：采用二肽片段Fmoc-Val-(Fmoc-Hmb)-Val-OH为原料引入，按照与1)相同的偶联方法将Fmoc-Val-(Fmoc-Hmb)-Val-OH偶联至1)所得到的的5肽树脂后，脱除Fmoc保护基得到7肽树脂。进一步地，2)中带Hmb保护基的7肽树脂可通过如下方法制备：通过还原胺化反应原位形成骨架保护基，将1)所得到的5肽树脂用对甲氧基水杨醛处理后再用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原，经洗涤后再偶联22位Val，得到7肽树脂。进一步地，3)中28肽树脂的制备具体包括以下步骤：a、将2)中所制备得到的7肽树脂加入到固相合成反应器中用溶剂充分溶胀，然后用20％的哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基后洗涤；b、将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和偶联剂加入到DMF中反应一段时间后，加入到固相合成反应器中，鼓氮气反应一段时间后洗涤；然后用20％的哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基后洗涤；重复上述过程，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。进一步地，1)中的固相载体选自RinkAmide树脂、RinkAmide-AM树脂或RinkAmide-MBHA树脂，固相载体的替代度为0.1～0.7mmol/g。固相载体的替代度优选为0.3～0.5mmol/g。进一步地，1)和3)中偶联用偶联剂为DIPCDI和HOBt的组合物，偶联剂中各成分与氨基酸原料的比例以物质的量比例计为DIPCDI：HOBt：氨基酸原料＝1.3：1.2：1。进一步地，裂解用裂解试剂为TFA、TIS和H2O的组合物，TFA、TIS、H2O的体积比为90：5：5。另外，采用其它包含Hmb-Val残基的寡肽片段引入23位Val的Hmb也是本领域专业人员能够容易本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胸腺肽Tα-1的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸至固相载体上，合成侧链带保护基的5肽树脂：NH

【技术特征摘要】
1.一种胸腺肽Tα-1的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸至固相载体上，合成侧链带保护基的5肽树脂：NH2-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-β-Asp(OtBu)-氨基树脂；
2)制备带Hmb保护基的7肽树脂：
NH2-Val-(Hmb)Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-β-Asp(OtBu)-氨基树脂；
3)按照Fmoc固相合成方法继续偶联1～21位的残基，得到28肽树脂：
NH2-Ser(tBu)-Asp-(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-(Hmb)Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-β-Asp(OtBu)-氨基树脂；
4)28肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到Tα-l粗肽。


2.根据权利要求1所述的胸腺肽Tα-1的合成方法，其特征在于，1)中所述5肽树脂的制备具体包括以下步骤：
a、将固相载体加入到固相合成反应器中用溶剂充分溶胀，然后用20％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基后洗涤；
b、将Fmoc-Asp-OtBu和偶联剂加入到N,N-二甲基甲酰胺中反应一段时间后，加入到固相合成反应器中，鼓氮气反应一段时间后洗涤；然后用20％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基后洗涤；重复上述过程，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。


3.根据权利要求1所述的胸腺肽Tα-1的合成方法，其特征在于，2)中所述带Hmb保护基的7肽树脂通过如下方法制备：
采用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Val-OH为原料引入，按照与1)相同的偶联方法将Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Val-OH偶联至1)所得到的5肽树脂后，脱除Fmoc保护基后通过对称酸酐法偶联22位Val，得到7肽树脂。


4.根据权利要求1所述的胸腺肽Tα-1的合成方法，其特征在于，2)中所述带Hmb保护基的7肽树脂可通过如下方法制备：
采用二肽片段Fmoc-Val-(Fmoc-Hmb)-Val-OH为原料引入，按照与1)相同的偶联方法将Fmoc-Val-(Fmoc-Hmb)-Val-...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚志军，宓鹏程，陶安进，袁建成，
申请(专利权)人：翰宇药业武汉有限公司，深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42