一种去氨加压素的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种去氨加压素的合成方法，包括以下步骤：1)固相载体树脂的选择；2)主链肽树脂的合成；3)裂解，脱除树脂及保护基；4)液相电化学氧化偶联二硫键得到去氨加压素。此种方法可以避免反应的专一选择性问题，能够提高片段肽树脂的利用率，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产成本，避免了化学氧化剂碘和双氧水的使用，更加环保，更加符合绿色化学的理念。

【技术实现步骤摘要】
一种去氨加压素的合成方法
本专利技术属于多肽类药物生产
，涉及一种去氨加压素的合成方法。
技术介绍
去氨加压素是天然精氨加压素的结构类似物，系对天然激素的化学结构进行两处改动而得，即1-半胱氨酸脱去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。去氨加压素的肽序如式Ⅰ所示，其中Mpa与Cys通过二硫键成环。去氨加压素主要用于治疗中枢性尿崩症、夜间遗尿及血友病等，也用于肾尿液浓缩功能的测试，还可用作术后止血。随着Fmoc固相肽合成方法的日益发展和制备工艺的日渐成熟，目前，多肽合成中，固相合成逐渐取代液相合成。对于去氨加压素的合成，主要采用的合成方法是Fmoc固相多肽合成策略。常规方法偶联合成去氨加压素的关键在于二硫键的构建，常规的肽合成中使用的构建二硫键的方法包括固相氧化法和液相氧化法。其中固相氧化剂包括碘和双氧水；液相氧化法包括空气氧化法、碘/醋酸体系氧化法和双氧水氧化法，这类方法无法保证反应的专一选择性，无可避免的会产生错配杂质，产品纯度较低，增加了纯化的难度。专利CN101372505A介绍了一种假稀释反应避免液相反应中存在的多肽链间二硫键错配问题，固相氧化合成二硫键，但固相成二硫键反应为非均相反应，反应转化率较低，导致产品去氨加压素收率偏低。同时氧化时使用碘，给环境造成污染，不利于环保，不利于产业的可持续性发展。开发原子经济性反应和环保已成为绿色化学研究的核心内容，从原子经济性的角度来讲，常规的依序偶联方法由于无法避免这种线性肽的二硫键的构建的专一选择性问题，导致L-型半胱氨酸和巯基丙酸二硫键的构建时，主链片段有效利用率较低，即原子利用率较低。在一般的固相合成操作过程中，氨基酸用量一般为3～5eqv，当主链片段有效利用率较低时将造成相应氨基酸的大量浪费。鉴于上述情况，本专利技术通过Fmoc/tBu策略固相连接主链氨基酸残基，裂解后粗肽通过电化学方法液相偶联半胱氨酸和巯基丙酸的侧链，形成二硫键，最后纯化得到去氨加压素。如此，可以避免反应的专一选择性问题，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产成本，避免了碘、双氧水等氧化剂的使用，更加环保，符合绿色化学的理念。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中所提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种去氨加压素的合成方法，该方法可以避免反应的专一选择性问题，提高主链片段利用率，提高原子利用率，降低生产成本，绿色环保。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种去氨加压素的合成方法，包括以下步骤：1)固相载体树脂的选择；2)主链肽树脂的合成；3)裂解，脱除树脂及保护基；4)液相电化学氧化偶联二硫键得到去氨加压素。进一步地，1)中固相载体树脂选自RinkAmideAMResin、RinkAmideMBHAResin或RinkAmideResin，固相载体树脂的替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.3-0.5mmol/g。进一步地，步骤2)中按照C端到N端的顺序偶联Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(P)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpa(Trt)-OH。其中Fmoc-Cys(P)-OH中P为Trt、Mmt或Dpm。固相多肽合成方法包括：1)脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；2)将合适量的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；3)重复1)和2)。其中脱除Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶：DMF(体积比)为1:4的混合溶液。反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的胺，即胺上无保护基。进一步地，步骤2)的反应在固相反应柱中进行。本专利技术所使用的固相反应柱无特别限制，为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。进一步地，2)中主链肽树脂的合成具体包括以下步骤：a、将固相载体树脂加入到固相反应柱中，用20％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基后洗涤；b、将Fmoc-Gly-OH和偶联剂加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在0～5℃活化后加入到固相反应柱中，在常压室温下反应1.5-4h后洗涤；然后用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基后洗涤；重复上述过程，依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(P)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpa(Trt)-OH，其中Fmoc-Cys(P)-OH中P为Trt、Mmt或Dpm。进一步地，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A选自HOBt或HOAt，化合物B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI：化合物A＝1.2：1.1，DIPEA：化合物A：化合物B＝2.0：1.1：1.0。优选为DIPCDI和化合物A的组合物。进一步地，步骤2)的反应优选将树脂在偶联之前进行溶胀，洗涤和溶胀的步骤本领域可采用实现该目的的任何试剂进行，包括DMF、NMP、二氯甲烷等，优选DMF。进一步地，裂解用裂解液为TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚的组合物，优选比例为TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝90：5：4：1(V:V)。进一步地，液相电化学氧化偶联二硫键为氧化偶联半胱氨酸和巯基丙酸，所用阴阳电极均为铂电极，所用电流为5mA-20mA，优选10-15mA，反应温度为10℃-100℃，优选35℃，电解质为四丁基高氯酸铵、四丁基四氟硼化铵或四丁基六氟膦化铵，优选四丁基四氟硼化铵。进一步地，4)后还包括纯化步骤，采用反相高压液相色谱法进行纯化制备精肽，反相高压液相色谱法包括以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。本专利技术的有益效果是，本专利技术提供了一种合成去氨加压素的方法，该方法通过Fmoc/tBu策略固相连接主链氨基酸残基，裂解、沉淀得到粗肽，然后通过电化学方法液相氧化偶联半胱氨酸，纯化后得到去氨加压素。此种方法可以避免反应的专一选择性问题，能够提高片段肽树脂的利用率，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去氨加压素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)固相载体树脂的选择；/n2)主链肽树脂的合成；/n3)裂解，脱除树脂及保护基；/n4)液相电化学氧化偶联二硫键得到去氨加压素。/n

【技术特征摘要】
1.一种去氨加压素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)固相载体树脂的选择；
2)主链肽树脂的合成；
3)裂解，脱除树脂及保护基；
4)液相电化学氧化偶联二硫键得到去氨加压素。


2.根据权利要求1所述的去氨加压素的合成方法，其特征在于，1)中所述固相载体树脂选自RinkAmideAMResin、RinkAmideMBHAResin或RinkAmideResin，所述固相载体树脂的替代度为0.1-1.0mmol/g。


3.根据权利要求2所述的去氨加压素的合成方法，其特征在于，所述固相载体树脂的替代度为0.3-0.5mmol/g。


4.根据权利要求1所述的去氨加压素的合成方法，其特征在于，2)中所述主链肽树脂的合成具体包括以下步骤：
a、将固相载体树脂加入到固相反应柱中，用20％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基后洗涤；
b、将Fmoc-Gly-OH和偶联剂加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在0～5℃活化后加入到固相反应柱中，在常压室温下反应1.5-4h后洗涤；然后用20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基后洗涤；重复上述过程，依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(P)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpa(Trt)-OH，其中Fmoc-Cys(P)-OH中P为Trt、Mmt或Dpm。


5.根据权利要求4所述的去氨加压素的合成方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学明，袁慧星，宓鹏程，陶安进，袁建成，
申请(专利权)人：翰宇药业武汉有限公司，甘肃成纪生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42