一种美曲普汀的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种美曲普汀的制备方法，具体是美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白。包涵体溶解和疏水层析复性均采用温和的方式进行，过程中还可以添加抗氧化剂和/或金属螯合剂，以抑制目的蛋白的氧化、降解。该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高，生物活性好。

【技术实现步骤摘要】
一种美曲普汀的制备方法
本专利技术涉及蛋白质工程
，具体涉及一种美曲普汀的制备方法。
技术介绍
美曲普汀(Metreleptin)是大肠杆菌表达系统表达的重组人瘦素衍生物(rmetHuLeptin)，含有147个氨基酸残基，与天然人瘦素蛋白相比，其N末端多一个甲硫氨酸残基，故又称为重组人甲硫氨酰瘦素蛋白。美曲普汀无糖基化修饰，其第97位半胱氨酸残基与第147位半胱氨酸残基形成链内二硫键，封闭其C-末端，相对分子量约为16.15kDa。2014年2月24日，美国FDA批准美曲普汀制剂上市(商品名：Myalept，Amylin公司产品)，用作补充疗法治疗先天性或获得性脂肪代谢障碍患者瘦素缺乏并发症，制剂规格：11.3mg/支。大肠杆菌(E.coli)表达系统，因其基因组信息研究清晰、基因操作简便，而为学术界和工业界广泛应用。但大肠杆菌细胞内缺乏氧化还原环境和翻译后加工修饰机制，所以许多大肠杆菌表达系统重组表达的外源性蛋白均无法正确折叠，从而形成不可溶的包涵体(IBs)。包涵体中主要是部分折叠或者错误折叠的目的蛋白的聚集体。要从包涵体中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种美曲普汀的制备方法，其特征在于，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；/n所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH 12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；/n所述疏水层析复性包括以下步骤：/n(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4M NaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的PhenylFast Flow 6(high)层析柱；/n(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗...

【技术特征摘要】
1.一种美曲普汀的制备方法，其特征在于，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；
所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；
所述疏水层析复性包括以下步骤：
(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4MNaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的PhenylFastFlow6(high)层析柱；
(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3～10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3～10个柱床体积；
(3)最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1含0.5MArg，2MNaCl，pH12；
所述平衡液2含0.5MArg，2MNaCl，pH10；
所述复性液1含20mMPB，0.5MNaCl，5％甘油(w/v)，0.01％Tween80(w/v)，pH＝8.0；
所述复性液2含20mMPB，0.15MNaCl，0.01％Tween80(w/v)，pH8.0；
所述洗脱液含0.01％Tween80(w/v)。


2.根据权利要求1所述的美曲普汀的制备方法，其特征在于，所述溶解液、平衡液1、平衡液2和复性液1的至少一种中还添加抗氧化剂。


3.根据权利要求1所述的美曲普汀的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂添加后的终浓度为1～100mg/ml。

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【专利技术属性】
技术研发人员：汤华东，梅芸，董瑶，童齐金，陈亚，
申请(专利权)人：武汉海特生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42