一种美曲普汀的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种美曲普汀的制备方法，具体是美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白。包涵体溶解和疏水层析复性均采用温和的方式进行，过程中还可以添加抗氧化剂和/或金属螯合剂，以抑制目的蛋白的氧化、降解。该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高，生物活性好。

【技术实现步骤摘要】
一种美曲普汀的制备方法
本专利技术涉及蛋白质工程
，具体涉及一种美曲普汀的制备方法。
技术介绍
美曲普汀(Metreleptin)是大肠杆菌表达系统表达的重组人瘦素衍生物(rmetHuLeptin)，含有147个氨基酸残基，与天然人瘦素蛋白相比，其N末端多一个甲硫氨酸残基，故又称为重组人甲硫氨酰瘦素蛋白。美曲普汀无糖基化修饰，其第97位半胱氨酸残基与第147位半胱氨酸残基形成链内二硫键，封闭其C-末端，相对分子量约为16.15kDa。2014年2月24日，美国FDA批准美曲普汀制剂上市(商品名：Myalept，Amylin公司产品)，用作补充疗法治疗先天性或获得性脂肪代谢障碍患者瘦素缺乏并发症，制剂规格：11.3mg/支。大肠杆菌(E.coli)表达系统，因其基因组信息研究清晰、基因操作简便，而为学术界和工业界广泛应用。但大肠杆菌细胞内缺乏氧化还原环境和翻译后加工修饰机制，所以许多大肠杆菌表达系统重组表达的外源性蛋白均无法正确折叠，从而形成不可溶的包涵体(IBs)。包涵体中主要是部分折叠或者错误折叠的目的蛋白的聚集体。要从包涵体中得到正确折叠，具有天然生物学活性的蛋白，通常采用复杂的“变性-复性”过程：首先使用高浓度的变性剂如8M尿素或6M盐酸胍溶解包涵体，将目的蛋白二级结构完全打开(变性)，再通过合适溶液使目的蛋白重新折叠，形成正确的结构(复性)。用大肠杆菌表达系统表达制备重组人瘦素蛋白或者其衍生物时，目的蛋白也主要以包涵体形式表达，获得有生理活性的瘦素蛋白通常使用的方法也是使用盐酸胍或尿素溶解后再复性。但这种包涵体的溶解方式会完全破坏蛋白质的结构，包括所有的二级结构，这样在蛋白质的复性(重折叠)过程中，容易折叠错误，引起蛋白聚集沉淀，从而复性失败，或者复性效率低，导致蛋白收得率低。常规复性采用稀释复性或透析复性方式，逐步脱除变性剂(尿素或盐酸胍)，在变性剂浓度逐级降低的同时目的蛋白会折叠、形成正确构象。由于稀释复性或透析复性方式很难真正实现变性剂浓度逐级降低，变性剂浓度的骤然下降时目的蛋白还来不及折叠成正确构象，往往形成错误构象，并聚集沉淀，导致复性效率低下；通常稀释复性或透析复性时包涵体溶解液与复性液的比例高达1:50～1:100，也不利于产业化放大或者放大成本高。因此，有必要开发一种易于产业化放大、收得率高的美曲普汀制备方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的美曲普汀在生物工程制备过程中常以包涵体形式存在，要经过复杂的变性、复性过程，难于产业化放大、收得率低等问题，本专利技术提供了一种新的美曲普汀的制备方法，整体技术方案是以原核表达系统表达美曲普汀，制得包涵体，采用一种较温和的方式溶解包涵体，并采用疏水层析进行复性。用该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高。下面详述本专利技术的技术方案：一种美曲普汀的制备方法，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；所述疏水层析复性包括以下步骤：(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4MNaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的PhenylFastFlow6(high)层析柱；(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3～10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3～10个柱床体积；(3)最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；所述平衡液1含0.5MArg，2MNaCl，pH12；所述平衡液2含0.5MArg，2MNaCl，pH10；所述复性液1含20mMPB，0.5MNaCl，5％甘油(w/v)，0.01％Tween80(w/v)，pH＝8.0；所述复性液2含20mMPB，0.15MNaCl，0.01％Tween80(w/v)，pH8.0；所述洗脱液含0.01％Tween80(w/v)。Arg：精氨酸，2-氨基-5-胍基-戊酸；PB：PB缓冲液，由NaH2PO4和Na2HPO4加纯化水配制而成。上述各溶液的溶剂均为水，各成分百分含量的单位w/v是重量体积比，例如5％甘油，即为100ml溶液中含5g甘油。为避免常规高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体对目的蛋白二级结构的破坏作用，本专利技术采用较温和的方式溶解包涵体，即高pH条件(0.5M～1M的Arg，pH12)溶解包涵体，这种包涵体溶解方式可以保留蛋白二级结构，从而增加复性效率；同时精氨酸还可帮助包涵体溶解以及目的蛋白的折叠、复性。本专利技术疏水层析复性采用逐级降低(梯度洗脱)目的蛋白所处的pH环境(pH12→pH10→pH8.0)，逐级降低(梯度洗脱)目的蛋白所处的盐离子浓度(2MNaCl→0.5MNaCl→0.15MNaCl)的方式，使目的蛋白得到充分时间折叠成正确构象；同时加入甘油和Tween80可提高暂时错误折叠构象蛋白的溶解度，避免其聚集沉淀，进一步提高了复性效率。同领域技术人员将会理解，对于层析工艺一旦确立工艺参数，是很容易实现线性放大的。美曲普汀基因通过原核表达系统表达，是将美曲普汀基因插入原核表达载体，构建成重组表达载体，重组表达载体导入原核表达菌株中，构建含有重组表达载体的基因工程菌，然后在适宜条件下培养基因工程菌，诱导美曲普汀在该基因工程菌中表达。原核表达载体是能携带插入的基因序列进入原核细胞中进行表达的载体，通常含有载体自主复制、目的基因表达、转录等所需的调控元件，包括复制起点(Ori)、启动子、转录终止子、操纵子、操纵子阻遏物基因等序列，以及筛选标记基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因等；载体上调控目的基因表达的启动子有多种类型，如λ噬菌体T7启动子(pET系列载体)、pL/pR启动子(pBV220载体)、冷休克基因CSPA启动子(pCold系列载体)等。可选或优选的，所述原核表达载体为pET32a(+)、pBV220或pColdIV。原核表达菌株优选大肠杆菌，大肠杆菌在选择时应考虑与所选用原核表达载体的相适配性，该适配性选择为本领域技术人员所能理解；例如若所选用原核表达载体为pET系列载体，由于该系列载体均使用λ噬菌体T7启动子启动目的基因的转录，而该T7启动子转录需要用到T7RNA聚合酶，可选择整合有λ噬菌体DE3片段(该片段中包含了编码T7RNA聚合酶的基因)的BL21(DE3)菌株；再比如选用pL/pR启动子启动目的基因转录的pBV220载体或CSPA启动子启动目的基因转录的pCold系列载体，均可选用BL21菌株作为表达菌株。将基因序列插入原核表达载体，构建成重组表达载体的技术为本领域公知常识，可参考J.萨姆布鲁克和M.R.格林主编的《分子克隆实验指南》，按“限制性内切酶酶切-连接”的方式插入原核表达载体多克隆位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种美曲普汀的制备方法，其特征在于，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；/n所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH 12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；/n所述疏水层析复性包括以下步骤：/n(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4M NaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的PhenylFast Flow 6(high)层析柱；/n(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3～10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3～10个柱床体积；/n(3)最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；/n所述平衡液1含0.5MArg，2M NaCl，pH 12；/n所述平衡液2含0.5MArg，2M NaCl，pH 10；/n所述复性液1含20mM PB，0.5M NaCl，5％甘油(w/v)，0.01％Tween80(w/v)，pH＝8.0；/n所述复性液2含20mM PB，0.15M NaCl，0.01％Tween80(w/v)，pH 8.0；/n所述洗脱液含0.01％Tween80(w/v)。/n...

【技术特征摘要】
1.一种美曲普汀的制备方法，其特征在于，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；
所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；
所述疏水层析复性包括以下步骤：
(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4MNaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的PhenylFastFlow6(high)层析柱；
(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3～10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3～10个柱床体积；
(3)最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1含0.5MArg，2MNaCl，pH12；
所述平衡液2含0.5MArg，2MNaCl，pH10；
所述复性液1含20mMPB，0.5MNaCl，5％甘油(w/v)，0.01％Tween80(w/v)，pH＝8.0；
所述复性液2含20mMPB，0.15MNaCl，0.01％Tween80(w/v)，pH8.0；
所述洗脱液含0.01％Tween80(w/v)。


2.根据权利要求1所述的美曲普汀的制备方法，其特征在于，所述溶解液、平衡液1、平衡液2和复性液1的至少一种中还添加抗氧化剂。


3.根据权利要求1所述的美曲普汀的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂添加后的终浓度为1～100mg/ml。

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【专利技术属性】
技术研发人员：汤华东，梅芸，董瑶，童齐金，陈亚，
申请(专利权)人：武汉海特生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42