用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺，涉及一种鼠神经生长因子的制备工艺，特别是用病毒灭活法制备的工艺。工艺步骤是将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液，然后离心、去沉淀，上离子交换层析Ⅰ，收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液，用注射用水稀释，向其中加入有机溶剂或有机溶剂和去污剂，然后上离子交换层析Ⅱ，收集目标蛋白峰，得收集液，收集液上离子交换层析Ⅲ，即得ＮＧＦ原液，再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品。本工艺在传统工艺中加入有机溶剂和去污剂，可有效灭活潜在病毒；加了一道离子交换层析，以利于有机溶剂和去污剂的除去。用本工艺所得制品纯度高、安全性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鼠神经生长因子的制备工艺，特别是用病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺。
技术介绍
鼠神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是从小鼠颌下腺中分离纯化的神经生长因子的冻干制品，其传统制备工艺为将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液；然后将匀浆上清液离心、去沉淀后，上离子交换层析I(CM-Sepharose FF柱)，收集流穿液；流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液；酸解上清上离子交换层析II(CM-Cellulose 52柱)，收集目标蛋白峰，即得NGF原液；再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品。由于鼠神经生长因子来源于小鼠，因而该制品存在生物安全性问题，主要是鼠源性病毒对原材料颌下腺的污染或潜在性污染。为了保证该制品的安全性，在控制供体鼠饲养环境和原材料颌下腺质量的同时，研究生产过程中去除或灭活病毒工艺对制品的安全性起着十分重要的作用。目前对于血液制品国内外较为成熟的病毒灭活/去除工艺方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品尤其是规模化生产量的鼠神经生长因子的病毒灭活工艺，国内外至今未见报道。巴氏消毒法和干热法属热力处理灭活病毒方法，即通过热力使病毒蛋白变性、破坏病毒结构从而灭活病毒，但热力也常使蛋白制品变性或生物学活性降低。故采用这两种病毒灭活方法时常在蛋白制品中加入保护剂，但保护剂在保护蛋白制品的同时也保护了病毒，降低了病毒灭活率。纳米膜过滤法主要利用病毒颗粒与蛋白分子的大小差异通过钠米级的滤膜把病毒除去，适用于分子量较小(直径较小)的蛋白，不适于较大直径蛋白制品的病毒去除，且纳米膜价格昂贵。光化学法是利用某些光敏剂对病毒表面及病毒核酸结构有强烈的亲和性，在适当波长的光照下易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构。光化学法对一些蛋白活性损伤较大。有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒而对蛋白的结构和功能影响甚微；该方法最大的难点是从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能灭活鼠神经生长因子中潜在的鼠源性病毒，保证鼠神经生长因子更安全有效地应用于临床的用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺。本专利技术的目的的实现方式为，用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺，将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液；然后将匀浆上清液离心、去沉淀后，上离子交换层析I(CM-Sepharose FF柱)，收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液，用注射用水稀释酸解上清液至所含蛋白浓度为2.7～3.3mg/ml，向其中加入有机溶剂，有机溶剂终浓度为2.00～2.35％(m/v)，于24～37℃水浴中恒温4～6小时，然后上离子交换层析II(CM-Cellulose 52柱)，收集目标蛋白峰，得收集液，收集液上离子交换层析III，即得NGF原液，再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品，离子交换层析III的介质为阳离子交换剂，有机溶剂为磷酸三丁酯。用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺，将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液；然后将匀浆上清液离心、去沉淀后，上离子交换层析I(CM-SepharoseFF柱)，收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液，用注射用水稀释酸解上清液至所含蛋白浓度为2.7～3.3mg/ml，向其中加入有机溶剂和去污剂，有机溶剂终浓度为0.25～1.35％(m/v)，去污剂终浓度为1.00～1.35％(m/v)，，于24～37℃水浴中恒温4～6小时，然后上离子交换层析II(CM-Cellulose 52柱)，收集目标蛋白峰，得收集液，收集液上离子交换层析III，即得NGF原液，再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品，离子交换层析III的介质为阳离子交换剂，有机溶剂为磷酸三丁酯，去污剂为聚山梨酯-80或Triton X-100，聚山梨酯-80终浓度为1.00～1.35％(m/v)，Triton X-100终浓度为1.00～1.35％(m/v)。本专利技术在传统工艺所得的酸化解离上清中加入一定浓度的有机溶剂和去污剂，于24～37℃保温4～6小时，能有效灭活潜在病毒，且灭活方法对制品质量无任何影响；在传统工艺中增加了一道离子交换层析(离子交换层析III)，因而在S/D法处理后应用了两次离子交换层析，可有效除去有机溶剂和去污剂残留，使制品纯度进一步提高。其去除有机溶剂和去污剂的原理是所选用的有机溶剂及去污剂为非离子型，不能与离子交换剂结合，而蛋白(NGF)与之结合，因而有机溶剂及去污剂同蛋白分离，在离子交换分离清洗过程中被除去。采用本工艺所得制品纯度高、安全性好。附图说明附图为本专利技术工艺中制备NGF原液的工艺流程示意图。具体实施例方式本专利技术的工艺步骤是将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液，然后离心、去沉淀，上离子交换层析I，收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液，用注射用水稀释酸解上清，向其中加入有机溶剂或有机溶剂和去污剂，然后上离子交换层析II，收集目标蛋白峰，得收集液，收集液上离子交换层析III，即得NGF原液，再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品。离子交换层析III的介质优选用CM-Cellulose 52或CM-Sepharose FF。下面举出本专利技术实施例实施例1.将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆液；然后将匀浆液离心，去沉淀，上清液上离子交换层析I(CM-Sepharose FF柱)，收集流穿液；流穿液进行酸化解离，离心，得酸解上清；酸解上清用注射用水稀释至蛋白浓度为3.3mg/ml，在其中加入2.00％(m/v)TNBP，于37℃水浴恒温4小时，然后上离子交换层析II(CM-Cellulose52柱)，收集目标蛋白峰；将收集液上离子交换层析III(CM-Sepharose FF柱)，收集目标蛋白峰，即为NGF原液；再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品。实施例2.同实施例1，不同的是，酸解上清液用注射用水稀释至蛋白浓度为2.7mg/ml，在其中加入2.35％(m/v)TNBP，于37℃水浴恒温4小时。实施例3.同实施例1，不同的是，酸解上清液用注射用水稀释至蛋白浓度为2.7mg/ml，在其中加入磷酸三丁酯(TNBP)和聚山梨酯-80(Tween-80)，终浓度分别0.30％(m/v)和1.00％(m/v)，于24℃水浴恒温6小时。实施例4.同实施例1，不同的是，酸解上清液用注射用水稀释至蛋白浓度为3.0mg/ml，在其中加入磷酸三丁酯(TNBP)和Triton X-100，终浓度分别0.25％(m/v)和1.35％(m/v)，于25℃水浴恒温6小时。实施例5.同实施例1，不同的是，酸解上清用注射用水稀释至蛋白浓度为3.3mg/ml，在其中加入TNBP和聚山梨酯-80(Tween-80)，终浓度分别1.35％(m/v)和1.00％(m/v)，于30℃水浴恒温4小时。实施例6.同实施例1，不同本文档来自技高网...
【技术保护点】
用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺，将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液；然后将匀浆上清液离心、去沉淀后，上离子交换层析Ⅰ（ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱），收集流穿液，流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液，其特征在于用注射用 水稀释酸解上清液至所含蛋白浓度为２．７～３．３ｍｇ／ｍｌ，向其中加入有机溶剂，有机溶剂终浓度为２．００～２．３５％（ｍ／ｖ），于２４～３７℃水浴中恒温４～６小时，然后上离子交换层析Ⅱ（ＣＭ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ５２柱），收集目标蛋白峰，得收集液，收集液上离子交换层析Ⅲ，即得ＮＧＦ原液，再加入赋形剂甘露醇和稳定剂白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品，离子交换层析Ⅲ的介质为阳离子交换剂，有机溶剂为磷酸三丁酯。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨国成，汤华东，江焕朝，李汝霖，陈亚，
申请(专利权)人：武汉海特生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。