抗神经生长因子抗体及其制备和使用方法技术

本发明专利技术提供了一种制备适用于犬的抗体的方法。还提供了与犬神经生长因子(NGF)特异性结合且中和犬NGF结合p75或TrkA犬NGF受体能力的犬源化抗体。本发明专利技术延及编码所述抗体的核酸和使用所述抗体和/或核酸治疗犬疼痛和关节炎的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了一种制备适用于犬的抗体的方法。还提供了与犬神经生长因子(NGF)特异性结合且中和犬NGF结合p75或TrkA犬NGF受体能力的犬源化抗体。本专利技术延及编码所述抗体的核酸和使用所述抗体和/或核酸治疗犬疼痛和关节炎的方法。【专利说明】
本专利技术涉及充当犬神经生长因子的拮抗剂抗体及其片段。本专利技术还涉及制备这些抗体的方法以及这些抗体和片段在治疗犬的与神经生长因子相关的病症中的治疗用途，例如疼痛、疼痛相关病症以及与导致慢性疼痛发作的病症。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽链、β多肽链和Y多肽链构成。NGF是神经营养因子家族的成员，其参与许多不同的作用。NGF促进感觉神经元和交感神经元的生存和分化，并且通过两类膜结合受体即低亲和性NGF受体ρ75和高亲和性NGF受体跨膜酪氨酸激酶TrkA来传达信号。NGF与TrkA或ρ75的结合导致感觉神经元中神经肽的上调。已经描述了使用NGF拮抗剂治疗人类的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.0p.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，国际专利申请W02006/131951描述了人源化形式的大鼠aDll(aDll)单克隆抗体。a Dll抗体对小鼠NGF具有结合特异性，但已知也与人类和大鼠形式的NGF结合。在施用至人之前，需要对a Dll大鼠衍生单克隆抗体进行人源化，从而使产生的中和抗体最少，该中和抗体是由人类对啮齿类衍生抗体的抗大鼠抗体(HAMA)反应产生的。而且，用人恒定结构域取代小鼠恒定结构域允许选择下游效应子功能。目前，通过施用数种镇痛剂包括局部和全身麻醉剂、麻醉性镇痛剂、α2拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAIDs)和类固醇来进行犬的疼痛管理。这些药物中的每一种都需要频繁地施用并且在功效和安全性方面也有局限性。因此，对于患有慢性疼痛例如患有癌痛或关节炎的犬，需要不频繁施用且持久有效的疼痛缓解。虽然NGF在犬组织中表达，并且已经表征了犬NGF分子(Eisele 1.WoodIS.German AJ.Hunter L.Trayhurn Ρ.，，Adipokine gene expression in dogadipose tissues and dog white adipocytes differentiated in primaryculture，，Hormone&Metabolic Research.37 (8): 474-81>2005Genbank XP_540250),但该文章既没有描述犬NGF的拮抗剂，也没有在犬中使用阻塞NGF介导的信号传导以防止或缓解疼痛。由于中和抗体的产生，因此在犬中使用在其他物种中充当抗NGF拮抗剂的已知抗体并不可行。而且，包含犬衍生恒定结构域和衍生自已知的抗NGF抗体例如CiDll的可变结构域的嵌合抗体的产生，并不能保证与犬NGF结合。此外，这样的抗体可以显示出与犬中可能存在但最初衍生该抗体的物种中不存在的其他靶表位的交叉反应。另外，中和抗体的产生将限制该抗体的长期治疗施用，当治疗与慢性疼痛相关的病症或癌病症况时，这是特别重要的条件。同样，使用CDR移植或相关的技术产生犬源化形式的抗NGF抗体可能导致中和抗体的产生，并且可能进一步显示抗原结合亲和性与亲合力的降低。因此，迫切需要用于犬疼痛治疗中充当犬NGF拮抗剂的结合成员(binding member),其中该结合成员保持高水平的结合亲和性与亲合力，同时避免了针对其的中和抗体的产生。专利技术概述经过大量的努力，本专利技术人意外地发现了一种制备抗体的方法，该抗体产生特异性结合犬NGF且中和犬NGF生物活性的非免疫原性抗体及其结合片段。特别是，出乎意料地，本文表明，本专利技术的抗体及其结合片段与犬NGF的结合，通过抑制犬NGF与高亲和性TrkA受体或与p75受体的结合,隔绝了犬NGF的生物活性。这反过来阻止了感知神经元中神经肽的上调，结果减轻或消除了痛觉。使用重组DNA方法生产抗体，并且出乎意料地该抗体是非免疫原性的，也就是说，在施用至犬个体之后，针对该抗体的中和抗体并未产生。由于使用标准方法例如CDR移植等并未产生抗体，因此这样的发现是令人惊讶且完全出乎意料的。根据本专利技术的第一方面，提供了制备适用于犬中的抗体的方法，其包括或基本上由以下步骤组成:从犬之外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对犬中存在的靶抗原有结合特异性；将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个犬抗体的框架区的氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基比较，以鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体的框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及用存在于一个或多个犬抗体中对应位置的一个或多个氨基酸残基来取代所述供体抗体中一个或多个鉴别出的氨基酸残基。本专利技术的方法修饰了犬中使用的供体抗体，这样的方法使得修饰的抗体的框架区内的任何位置不含有在犬中的该位置将是外来的任何氨基酸。因此，修饰的抗体保持了供体抗体对靶抗原的特异性和亲和性，但重要的是修饰并没有产生潜在的外来表位。因此，在犬中，修饰的抗体不被看做外来的，并且尤其是在长期施用后，也没有在犬中引起可能导致抗体功效的中和的免疫反应。`在某些实施方案中，取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括，用存在于对应位置的与所述一个或多个取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基来取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。在某些实施方案中，该方法还包括用衍生自犬抗体的重链和/或轻链的恒定结构域取代所述供体抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的步骤。通常，该重链的恒定结构域被HCA或HCD犬恒定结构域取代。在某些实施方案中，靶抗原是神经生长因子(NGF)。本专利技术第一方面的方法并不包括CDR移植。根据本专利技术第一方面的方法制备的抗体包含供体抗体的CDR、根据本专利技术的第一方面的方法制备的犬源化框架区，以及犬的恒定结构域。本专利技术延及根据本专利技术的第一方面例如以下的描述制备的抗体。因此，根据本专利技术的另一方面，提供了特异性结合犬神经生长因子(NGF)的犬源化抗体或其结合片段。通常，当与NGF结合时，犬源化抗体或其结合片段中和NGF生物功能。也就是说，犬源化抗体或结合片段与NGF的结合隔绝了 NGF与TrkA受体或与p75受体结合的能力。在某些实施方案中，犬源化抗体或其结合片段与NGF结合的结合亲和力Kd为IxKT8或更小。在本专利技术的另一或相关方面，提供了中和抗体或其抗原结合片段，其能够与犬神经生长因子(NGF)特异性结合，该抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为:包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或与其具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选为约25个氨基酸的长度上。在一些实施方案中，中和抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是犬源化抗体，即具有已经去免疫的氨基酸序列的抗体，从而，当施用至犬后，并不产生针对所述抗体的中和抗体。在某些实施方案中，根据本专利技术第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备适用于犬的抗体的方法，包括以下步骤：从犬以外的物种中提供供体抗体，其中所述供体抗体对所述犬中存在的靶抗原具有结合特异性；将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个犬抗体框架区氨基酸序列中对应位置存在的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体抗体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体框架区氨基酸序列内对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及用所述一个或多个犬抗体中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·吉尔芮，
申请(专利权)人：NVIP私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU