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罗氏沼虾胸腺肽β4基因、蛋白及其制备方法和应用技术

技术编号:25171621 阅读:81 留言:0更新日期:2020-08-07 21:02
本发明专利技术属于分子生物学基因工程领域,涉及罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)胸腺肽β4基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列,尤其涉及罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的重组表达制备方法。通过重组表达MrThyβ4蛋白可以克服在纯化分离过程,产量低的问题,进一步研究该蛋白的功能,为该蛋白在生物、医药和农业等研究领域的广泛应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
罗氏沼虾胸腺肽β4基因、蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学基因工程领域,涉及罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列,尤其涉及罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4蛋白的重组表达制备方法。
技术介绍
胸腺肽广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内,根据等电点的不同可分为Tα、Tβ、Tγ等3类。胸腺肽的功能域是一个thymosin(THY)的结构域,无脊椎动物体内的β-胸腺素蛋白通常有多个结构域。目前胸腺肽参与机体多种生物学功能,包括调节肌动蛋白,重塑细胞骨架。另外,β-胸腺素蛋白还能够在细胞运动、内吞、免疫调节和级联反应、肿瘤诊断与治疗、发育和创伤愈合等生理活动中发挥着重要的作用。目前脊椎动物的胸腺肽已经被开发成治疗肿瘤、病毒性肝炎等疾病的临床药物,而胸腺肽蛋白在进化过程中高度保守,虾体内分离的胸腺肽蛋白也有着重要的生物学活性。罗氏沼虾是我国主要养殖的淡水虾类品种之一。其适应能力强,生长速度快,养殖范围广,给养殖户带来了巨大的收益。但是虾类属于无脊椎动物,缺乏适应性免疫系统,主要以先天性免疫防御为主。而罗氏沼虾的强适应性和抗应激能力,与其强大的先天性免疫系统有关。胸腺肽蛋白是虾类先天性免疫的一种效应分子,在抗病过程中发挥着重要的作用。因此开发虾类自身的特异性免疫抗病因子,研究其功能活性,加强其对病害的抵抗能力。然而直接从虾体内分离胸腺肽的工艺复杂,成本高,产量低,通过传统的原核表达重组方法也难以实现胸腺肽β4蛋白的稳定高效表达。因此本专利技术方案结合合成生物学和生物工程技术,对胸腺肽β4基因进行改造,并在大肠杆菌中实现高效表达。
技术实现思路
为解决上述技术问题,本专利技术提供了罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的重组表达制备方法及应用,通过重组表达MrThyβ4蛋白可以克服在纯化分离过程,产量低的问题。本专利技术的技术方案如下:一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因,所述罗氏沼虾胸腺肽β4基因命名为MrThyβ4,序列如SEDIDNO:1所示。一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因,其序列如SEDIDNO:2所示。一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白,其序列如SEDIDNO:3所示。一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法,包括以下步骤:将MrThyβ4密码子优化后的序列SEQIDNo.2直接连入pET30a载体,通过转化到大肠杆菌BL21感受态细胞,挑选单克隆进行摇菌,IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE蛋白检测,超声破碎裂解细菌,纯化复性。进一步的,转化步骤为:取感受态细胞E.coliBL21放于冰中,待其融化;向感受态细胞中加入重组质粒,轻轻混匀内容物,在冰浴中静置3min;将离心管置于42℃水浴90s,迅速转移至冰浴中,冷却2-3min,勿摇动;向每个离心管中加入900μL的无菌LB培养基,混匀后置于37℃摇床振荡培养45min,使菌体复苏;将复苏好的菌液置于离心机中,1000rpm,离心3min,吸弃850μL的上清,混匀后吸取感受态细胞加入到含相应抗生素的LB固体培养基上,用无菌弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开,置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12-16h。进一步的,诱导表达步骤为:挑选含有重组质粒的大肠杆菌,加入至250mLLB液体培养基,37℃震荡培养直至菌液OD600=0.4~0.6;取上述菌液作为对照并进行保种,剩余菌液加入适量IPTG至终浓度1mM,37℃继续培养2~3h;将经IPTG诱导后的菌液,8000rpm,4℃,离心10min,小心倒掉上清,收集菌体沉淀;向上述沉淀中加入约20mL灭菌水重悬菌体,放入-80℃冻存,并反复冻融1-2次;取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎,破碎结束后菌液逐渐变得澄清,将破碎后的菌液置于4℃,8000rpm,离心10min,并将上清放入一个新的50mL离心管,把上清和沉淀置于-20℃保存;取诱导前、后菌液,破碎后上清和沉淀各加入适量上样缓冲液,混匀离心,99.9℃煮沸变性5min,进行SDS-PAGE电泳分析,确定重组蛋白的表达形式。进一步的,破碎条件为:破碎3s,间隔2s,破碎30min。进一步的,纯化复性步骤为:将半透膜在沸水中微沸煮5-7min,处理好之后向其中加入纯化的重组蛋白,密封好之后将半透膜置于透析复性液中,12h更换一次复性液,取复性之后的重组蛋白于干净的离心管中,5000rpm离心5min,取上清置于-20℃保存。进一步的,复性液中尿素浓度依次为6M、4M、3M、2M、1M、0M。本专利技术还提供上述罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白制备的方法在制药领域中的应用。本专利技术的第一个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因序列;本专利技术的第二个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4蛋白序列;本专利技术的第三个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4密码子优化后的核苷酸序列;本专利技术的第四个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4蛋白的重组表达及复性方法。所述的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因的分子类型是cDNA序列:长度501bp,类型是双链、线性、核酸,所述的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因MrThyβ4的序列通过PCR扩增,并进行测序获得。PCR特异性引物如下:F-5’-ATGAGTACCGAAACCGCCC-3’,R-5’-TTAGGCGTTCTTCTCCTGC-3’。具体序列如下所示,记为SEQIDNo.1:ATGAGTACCGAAACCGCCCTCAAGGATCTCCCCAAGGTCGACCCCACCCTCAAGGGCCAGCTGGAAGGATTCACCCCCGACAAACTCAAGAAGACCGACACAGAGGAGAAGACCATCTTGCCTTCCAAAGAGGACGTGGAAAGTGAGAAGCTTCGGAACGAACACCTGGAGAACATCAGCAAATTCCCGAGTGGGAGGCTGAAACGCACCTCTACTTCGGAGAAAATTGTCCTCCCCTCTAGCGCAGATGTGGAAGCCGAGAAGAAAGAAAAAGCCCACCTACAGGCTGTGGAGGGCTTCAATGCAGCCAATTTGAAGCATGCAAACACGAAAGAGAAAATTGTGTTGCCGGCCAAAGAAGATATCGAGAAAGAAAAGGGTCAGCAGGCGCTGTTCCAAGGAATCGAAGGATTCAACCAATCTAATCTTAAGAAGACTGAAACACAGGAGAAGAACCCTCTCCCAACTAAGGAGATAATCGAGCAGGAGAAGA本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因,其特征在于,所述罗氏沼虾胸腺肽β4基因命名为MrThyβ4,序列如SED ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因,其特征在于,所述罗氏沼虾胸腺肽β4基因命名为MrThyβ4,序列如SEDIDNO:1所示。


2.一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因,其特征在于,其序列如SEDIDNO:2所示。


3.一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白,其特征在于,其序列如SEDIDNO:3所示。


4.一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将MrThyβ4密码子优化后的序列SEQIDNo.2直接连入pET30a载体,通过转化到大肠杆菌BL21感受态细胞,挑选单克隆进行摇菌,IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE蛋白检测,超声破碎裂解细菌,纯化复性。


5.根据权利要求4所述的罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法,其特征在于,转化步骤为:取感受态细胞E.coliBL21放于冰中,待其融化;向感受态细胞中加入重组质粒,轻轻混匀内容物,在冰浴中静置3min;将离心管置于42℃水浴90s,迅速转移至冰浴中,冷却2-3min,勿摇动;向每个离心管中加入900μL的无菌LB培养基,混匀后置于37℃摇床振荡培养45min,使菌体复苏;将复苏好的菌液置于离心机中,1000rpm,离心3min,吸弃850μL的上清,混匀后吸取感受态细胞加入到含相应抗生素的LB固体培养基上,用无菌弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开,置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12-16h。


6.根据权利要求4所述的罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法,其特征在于,诱导表达步骤为:挑选含有重组质粒的大肠杆菌,加入...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨辉熊浩然付立霞张莹莹
申请(专利权)人:扬州大学
类型:发明
国别省市:江苏;32

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