本发明专利技术属于分子生物学基因工程领域，涉及罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)胸腺肽β4基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列，尤其涉及罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的重组表达制备方法。通过重组表达MrThyβ4蛋白可以克服在纯化分离过程，产量低的问题，进一步研究该蛋白的功能，为该蛋白在生物、医药和农业等研究领域的广泛应用奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
罗氏沼虾胸腺肽β4基因、蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学基因工程领域，涉及罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列，尤其涉及罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4蛋白的重组表达制备方法。
技术介绍
胸腺肽广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内，根据等电点的不同可分为Tα、Tβ、Tγ等3类。胸腺肽的功能域是一个thymosin(THY)的结构域，无脊椎动物体内的β-胸腺素蛋白通常有多个结构域。目前胸腺肽参与机体多种生物学功能，包括调节肌动蛋白，重塑细胞骨架。另外，β-胸腺素蛋白还能够在细胞运动、内吞、免疫调节和级联反应、肿瘤诊断与治疗、发育和创伤愈合等生理活动中发挥着重要的作用。目前脊椎动物的胸腺肽已经被开发成治疗肿瘤、病毒性肝炎等疾病的临床药物，而胸腺肽蛋白在进化过程中高度保守，虾体内分离的胸腺肽蛋白也有着重要的生物学活性。罗氏沼虾是我国主要养殖的淡水虾类品种之一。其适应能力强，生长速度快，养殖范围广，给养殖户带来了巨大的收益。但是虾类属于无脊椎动物，缺乏适应性免疫系统，主要以先天性免疫防御为主。而罗氏沼虾的强适应性和抗应激能力，与其强大的先天性免疫系统有关。胸腺肽蛋白是虾类先天性免疫的一种效应分子，在抗病过程中发挥着重要的作用。因此开发虾类自身的特异性免疫抗病因子，研究其功能活性，加强其对病害的抵抗能力。然而直接从虾体内分离胸腺肽的工艺复杂，成本高，产量低，通过传统的原核表达重组方法也难以实现胸腺肽β4蛋白的稳定高效表达。因此本专利技术方案结合合成生物学和生物工程技术，对胸腺肽β4基因进行改造，并在大肠杆菌中实现高效表达。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的重组表达制备方法及应用，通过重组表达MrThyβ4蛋白可以克服在纯化分离过程，产量低的问题。本专利技术的技术方案如下：一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因，所述罗氏沼虾胸腺肽β4基因命名为MrThyβ4，序列如SEDIDNO：1所示。一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因，其序列如SEDIDNO：2所示。一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白，其序列如SEDIDNO：3所示。一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法，包括以下步骤：将MrThyβ4密码子优化后的序列SEQIDNo.2直接连入pET30a载体，通过转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选单克隆进行摇菌，IPTG诱导表达，收集菌体进行SDS-PAGE蛋白检测，超声破碎裂解细菌，纯化复性。进一步的，转化步骤为：取感受态细胞E.coliBL21放于冰中，待其融化；向感受态细胞中加入重组质粒,轻轻混匀内容物，在冰浴中静置3min；将离心管置于42℃水浴90s，迅速转移至冰浴中，冷却2-3min，勿摇动；向每个离心管中加入900μL的无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min，使菌体复苏；将复苏好的菌液置于离心机中，1000rpm，离心3min，吸弃850μL的上清，混匀后吸取感受态细胞加入到含相应抗生素的LB固体培养基上，用无菌弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开，置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。进一步的，诱导表达步骤为：挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入至250mLLB液体培养基，37℃震荡培养直至菌液OD600＝0.4～0.6；取上述菌液作为对照并进行保种，剩余菌液加入适量IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养2～3h；将经IPTG诱导后的菌液，8000rpm，4℃，离心10min，小心倒掉上清，收集菌体沉淀；向上述沉淀中加入约20mL灭菌水重悬菌体，放入-80℃冻存，并反复冻融1-2次；取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎，破碎结束后菌液逐渐变得澄清，将破碎后的菌液置于4℃，8000rpm，离心10min，并将上清放入一个新的50mL离心管，把上清和沉淀置于-20℃保存；取诱导前、后菌液，破碎后上清和沉淀各加入适量上样缓冲液，混匀离心，99.9℃煮沸变性5min，进行SDS-PAGE电泳分析，确定重组蛋白的表达形式。进一步的，破碎条件为：破碎3s，间隔2s，破碎30min。进一步的，纯化复性步骤为：将半透膜在沸水中微沸煮5-7min，处理好之后向其中加入纯化的重组蛋白，密封好之后将半透膜置于透析复性液中，12h更换一次复性液，取复性之后的重组蛋白于干净的离心管中，5000rpm离心5min，取上清置于-20℃保存。进一步的，复性液中尿素浓度依次为6M、4M、3M、2M、1M、0M。本专利技术还提供上述罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白制备的方法在制药领域中的应用。本专利技术的第一个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因序列；本专利技术的第二个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4蛋白序列；本专利技术的第三个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4密码子优化后的核苷酸序列；本专利技术的第四个目的是提供罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4蛋白的重组表达及复性方法。所述的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因的分子类型是cDNA序列:长度501bp，类型是双链、线性、核酸，所述的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)胸腺肽β4基因MrThyβ4的序列通过PCR扩增，并进行测序获得。PCR特异性引物如下：F-5’-ATGAGTACCGAAACCGCCC-3’，R-5’-TTAGGCGTTCTTCTCCTGC-3’。具体序列如下所示，记为SEQIDNo.1：ATGAGTACCGAAACCGCCCTCAAGGATCTCCCCAAGGTCGACCCCACCCTCAAGGGCCAGCTGGAAGGATTCACCCCCGACAAACTCAAGAAGACCGACACAGAGGAGAAGACCATCTTGCCTTCCAAAGAGGACGTGGAAAGTGAGAAGCTTCGGAACGAACACCTGGAGAACATCAGCAAATTCCCGAGTGGGAGGCTGAAACGCACCTCTACTTCGGAGAAAATTGTCCTCCCCTCTAGCGCAGATGTGGAAGCCGAGAAGAAAGAAAAAGCCCACCTACAGGCTGTGGAGGGCTTCAATGCAGCCAATTTGAAGCATGCAAACACGAAAGAGAAAATTGTGTTGCCGGCCAAAGAAGATATCGAGAAAGAAAAGGGTCAGCAGGCGCTGTTCCAAGGAATCGAAGGATTCAACCAATCTAATCTTAAGAAGACTGAAACACAGGAGAAGAACCCTCTCCCAACTAAGGAGATAATCGAGCAGGAGAAGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因，其特征在于，所述罗氏沼虾胸腺肽β4基因命名为MrThyβ4，序列如SED ID NO：1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因，其特征在于，所述罗氏沼虾胸腺肽β4基因命名为MrThyβ4，序列如SEDIDNO：1所示。
2.一种罗氏沼虾胸腺肽β4基因，其特征在于，其序列如SEDIDNO：2所示。
3.一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白，其特征在于，其序列如SEDIDNO：3所示。
4.一种罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将MrThyβ4密码子优化后的序列SEQIDNo.2直接连入pET30a载体，通过转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选单克隆进行摇菌，IPTG诱导表达，收集菌体进行SDS-PAGE蛋白检测，超声破碎裂解细菌，纯化复性。
5.根据权利要求4所述的罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法，其特征在于，转化步骤为：取感受态细胞E.coliBL21放于冰中，待其融化；向感受态细胞中加入重组质粒,轻轻混匀内容物，在冰浴中静置3min；将离心管置于42℃水浴90s，迅速转移至冰浴中，冷却2-3min，勿摇动；向每个离心管中加入900μL的无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min，使菌体复苏；将复苏好的菌液置于离心机中，1000rpm，离心3min，吸弃850μL的上清，混匀后吸取感受态细胞加入到含相应抗生素的LB固体培养基上，用无菌弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开，置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。
6.根据权利要求4所述的罗氏沼虾胸腺肽β4蛋白的制备方法，其特征在于，诱导表达步骤为：挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨辉，熊浩然，付立霞，张莹莹，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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