一种普兰林肽的二硫类似物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种普兰林肽的二硫类似物及其制备方法，通过对多肽药物普兰林肽进行二硫键的替换得到一种还原条件下稳定的普兰林肽二硫类似物。目标多肽的合成是通过Fmoc固相合成方法实现，粗品经纯化，冻干得到普兰林肽的二硫类似物。还原稳定性实验表明本发明专利技术普兰林肽的二硫类似物具有良好的还原稳定性。

A disulfide analogue of pranlin peptide and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种普兰林肽的二硫类似物及其制备方法
本专利技术涉及一种普兰林肽的二硫类似物及其制备方法。
技术介绍
糖尿病是一种常见的内分泌疾病，在中国就有超过1亿的人患糖尿病。糖尿病是一种慢性疾病，以高血糖为特征，具有包括疲劳、视力模糊、口渴和尿频等令人痛苦的日常症状。如果高血糖不能得到及时控制和治疗，就会引起糖尿病酮症酸中毒和高渗性高血糖，这是糖尿病2种最严重的急性代谢并发症。普兰林肽是一种胰淀粉素类似物，是一种有效的治疗方法，与胰岛素协同调节患者血糖平衡。普兰林肽含37个氨基酸以及一对二硫键，半衰期在38分钟左右。研究表明，二硫键在维持普兰林肽三维空间结构中发挥着重要的作用。然而，二硫键在体内还原条件下是不稳定的，容易被硫醇还原，导致多肽结构重排和生物活性的丧失。因此，寻找一种稳定的二硫键的替代键具有重要的意义。
技术实现思路
针对普兰林肽的二硫键在体内还原环境中应用潜在的缺陷，本专利技术旨在提供一种普兰林肽的二硫类似物及其制备方法。本专利技术利用二氨基二酸Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH把普兰林肽中对还原体系不稳定的二硫键替换成稳定的硫醚键。还原稳定性实验表明本专利技术普兰林肽的二硫类似物具有良好的还原稳定性。本专利技术普兰林肽的二硫类似物，是通过使用二氨基二酸实现普兰林肽二硫键的替换后获得的。所述二氨基二酸为Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH，其结构式如下：本专利技术普兰林肽的二硫类似物，具有如下结构：本专利技术普兰林肽的二硫类似物的制备方法，包括如下步骤：步骤1：合成酰肼树脂将37.5mg2-CI-Trt树脂(载量0.40mmol/g,15umol)用375uLDMF溶胀，在冰盐浴和搅拌的条件下滴加50uLDIEA(300umol)、15uLN2H4·H2O(300umol)和150uLDMF的混合液反应20分钟，随后将反应体系置于室温条件下继续反应70分钟后，加入7.5uLMeOH(185umol)反应20分钟，所得树脂依次用DMF、MeOH、乙醚洗涤5次，55℃真空干燥1h后即可得到合成多肽酰肼的酰肼树脂。步骤2：Fmoc固相合成法合成酰肼多肽2a、将步骤1获得的酰肼树脂转移到固相合成管中，用DMF溶胀15分钟，加入现配制的DIC、Oxyma、酰肼多肽C端第1个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma：4.5倍当量保护的目标C肽端第1个氨基酸，500uLDMF)，于55℃反应40分钟，将树脂用DMF洗涤，随后用封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89，V％)浸泡树脂2分钟，再一次用DMF洗涤树脂。外加20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟。用大量DMF洗涤后，依肽序采用Fmoc固相合成法缩合氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。对于特殊氨基酸Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH的缩合，配置混合液(2倍当量PyBOP：2倍当量Oxyma：500uLDMF:1.5倍当量Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH)加入树脂常温过夜反应。当酰肼多肽C端第10个氨基酸Fmoc-Asn(Trt)-OH缩合完成之后，配制Pd(PPh3)4和N-甲基苯胺的THF混合液(1倍当量Pd(PPh3)4:28倍当量的N-甲基苯胺：500uLTHF)，加入树脂中避光常温反应2小时；所得树脂依次用DMF、DMF配制的0.5％NaS2CN(C2H5)2溶液、DCM、DMF洗涤。外加20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，DMF洗涤树脂。配制PyAOP、HOAT和NMM的DMF混合液(5倍当量PyAOP：5倍当量HOAT：10倍当量NMM:500uLDMF)，加入树脂中反应4小时，反应结束后所得树脂用大量DMF洗涤。依肽序采用Fmoc固相合成法继续缩合氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH。2b、当酰肼多肽最后一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH缩合结束后，将树脂用大量DMF、DCM洗涤，自然干燥后，外加切割试剂(TFA：苯酚：水：TIPS＝88:5:5:2,V％)0.5mL-0.8mL处理2小时。收集切割试剂，加入15倍体积当量的冰乙醚沉淀，离心粉末状初肽，半制备HPLC纯化酰肼多肽。分析HPLC和质谱确认产物(图3a，3b)，真空冷冻干燥得到纯化的酰肼多肽H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-NHNH2(Cys2-Ala7，硫醚键)。步骤3：Fmoc固相合成法合成半胱氨酸多肽3a、将45.5mgRinkAmide-AM树脂(载量0.33mmol/g,15umol)转移到固相合成管中并用DMF溶胀15分钟，外加20％哌啶的DMF溶液浸泡树脂8分钟和6分钟，用大量DMF洗涤树脂。配制DIC、Oxyma和半胱氨酸多肽C端第一个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma：500uLDMF:4.5倍当量保护的目标肽端第一个氨基酸)，加入树脂中于55℃反应40分钟，用大量DMF洗涤树脂。封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89,V％)浸泡树脂2分钟，再次用大量DMF洗涤树脂。外加20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，用大量DMF洗涤树脂后，依肽序采用Fmoc固相合成法缩合氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH。3b、待半胱氨酸多肽最后一个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH缩合结束后，将树脂用大量DMF、DCM洗涤，自然干燥后，外加切割试剂(TFA：苯酚：水：TIPS＝88:5:5:2,V％)0.5mL-0.8mL处理2小时；收集切割试剂，外加15倍体积当量的冰乙醚沉淀，离心粉末状初肽；半制备HPLC纯化目标肽。分析HPLC和质谱确认产物(图4b,4c)，真空冷冻干燥得到纯化的半胱氨酸多肽H-Cys-Asn-Phe-Le本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普兰林肽的二硫类似物，其特征在于：/n所述普兰林肽的二硫类似物是通过使用二氨基二酸实现普兰林肽二硫键的替换后获得的；/n所述二氨基二酸为Fmoc-A

【技术特征摘要】
1.一种普兰林肽的二硫类似物，其特征在于：
所述普兰林肽的二硫类似物是通过使用二氨基二酸实现普兰林肽二硫键的替换后获得的；
所述二氨基二酸为Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH，其结构式如下：





2.一种权利要求1所述的普兰林肽的二硫类似物，其特征在于具有如下结构：





3.一种权利要求1或2所述的普兰林肽的二硫类似物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：合成酰肼树脂
将2-CI-Trt树脂用DMF溶胀，在冰盐浴和搅拌的条件下滴加DIEA、N2H4·H2O和DMF的混合液反应，随后将反应体系置于室温条件下继续反应，接着加入MeOH进行反应，得到合成酰肼多肽的酰肼树脂；
步骤2：Fmoc固相合成法合成酰肼多肽
将步骤1获得的酰肼树脂转移到固相合成管中，DMF溶胀后采用Fmoc固相合成法依次进行氨基酸的缩合连接，当酰肼多肽C端第10个氨基酸Fmoc-Asn(Trt)-OH缩合完成之后，脱除树脂肽Alloc和Ally保护基团，Fmoc保护基团后分子内环化，依肽序采用Fmoc固相合成法继续缩合氨基酸；当固相合成结束后，外加切割试剂反应2小时，冰乙醚沉淀纯化后得到酰肼多肽H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Ala-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-NHNH2(Cys2-Ala7，硫醚键)；
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【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，朱良静，方葛敏，朱满洲，
申请(专利权)人：合肥修合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34