一种线粒体靶向透膜环肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种线粒体靶向透膜环肽及其制备方法和用途，其中线粒体靶向肽的结构如下：

【技术实现步骤摘要】
一种线粒体靶向透膜环肽及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种线粒体靶向透膜环肽的化学合成，以及线粒体靶向透膜环肽在活性物质递送方面的应用。
技术介绍
线粒体的主要功能是高效地将有机物中储存的能量转化为细胞生命活动的直接能源，供细胞生命活动的需要。作为动物细胞呼吸的主要场所，线粒体有着“动力工厂”的美誉。线粒体在维持细胞的正常活动发挥着至关重要的作用。线粒体参与着细胞生命过程的多个环节，包括细胞生理学、活性氧的产生、钙稳态和细胞程序性凋亡。线粒体功能异常与多种疾病的发生密切相关，如：脑坏死、心肌病、肿瘤、不育、帕金森综合征等。细胞膜的选择通透性和线粒体双层膜的高负膜电势，成为大分子生物活性物质进入线粒体的巨大屏障。生物活性物质无法靶向递送到线粒体，使得线粒体相关疾病的治疗难以攻克。随着靶向线粒体的分子工具的发展，实现了对线粒体选择性生物成像。使得功能性干预和治疗线粒体相关疾病成为可能。过去的几十年时间里，人们在不断探索，如何将不同种类的生物活性物质靶向递送到线粒体，来实现对有关线粒体疾病的调控和治疗。通过人们一步步的努力。目前，将药物靶向地传递到线粒体的最常见的方法是将亲脂阳离子(如烷基三苯膦基)与感兴趣的药物基共价连接。纳米颗粒以及天然和合成线粒体靶向肽载体，也被用于线粒体小分子的传递。不同种类的活性生物分子，需要不同种类和结构的载体来实现靶向递送的目的。线粒体靶向技术的发展，为研究线粒体生理和功能障碍，以及线粒体与其他亚细胞细胞器之间的相互联系打开了一扇新窗口，对于治疗各种线粒体相关疾病提供了一个新思路。值得我们注意的是，以线粒体靶向肽作为传递支架，具有其独特的优势，如易于合成、可调性、生物相容性以及在细胞和体内的高摄取等特性。简单的固相合成法能够实现不同序列的合成，多样的侧链基团可以满足不同类型物质的修饰。由于其简单和模块化的合成和多个可供修饰的结构位点，这些肽是非常适合交付不同类型的货物。Kelley和他的同事开发出的由非天然氨基酸—环已基丙氨酸和D型精氨酸组成的阳离子肽表现出较好的线粒体靶向能力。运用这一结构已成功的将抗肿瘤药物(Dox)、siRNA、质粒DNA等生物活性分子成功运输到线粒体，通过对肽序列的修改或者引入人工合成的氨基酸侧链，可以提高其特异性。然而，即使是最小的序列改变也可以对肽的穿膜输送活性造成巨大影响。因此，优化和提供多样的线粒体靶向肽，对生物活性分子的递送和线粒体疾病的治疗有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术针对线粒体靶向肽不易修饰的缺点，旨在提供一种线粒体靶向透膜环肽及其制备方法和用途。本专利技术通过对已报道的线粒体透膜肽的优化，以便形成一种结构更加稳定、可修饰性高的线粒体靶向肽。另外，本专利技术还对筛选出来的线粒体穿透肽进行细胞成像实验。与商业线粒体染料进行对比，来评测线粒体穿透肽的穿透细胞膜的效果。本专利技术线粒体靶向透膜环肽，简记为CMPP-1，其结构通式如下式I所示：本专利技术线粒体靶向透膜环肽的制备方法，包括如下步骤：步骤1：合成酰肼树脂将2-Cl-Trt-Cl树脂200mg加入2mLDMF中溶胀，在冰浴以及搅拌的条件下滴加266uLDIEA(N,N-二异丙基乙胺)、80uL水合肼和800uLDMF的混合溶液，冰浴下搅拌20min，然后将体系转移至常温下搅拌反应70min，加入40uL甲醇结束反应；将得到酰肼-Trt(2-Cl)树脂转移至沙芯漏斗中，依次用DMF、MeOH、乙醚充分洗涤3-5次，真空干燥1h。步骤2：CMPP-1的合成方法将步骤1获得的酰肼-Trt(2-Cl)树脂用Fmoc固相合成法序列为Boc-C(Trt)-K(Alloc)-r(Pbf)-Cha-r(Pbf)-Cha-r(Pbf)的酰肼多肽；然后将赖氨酸(K)上的Alloc侧链保护基脱保护，将赖氨酸侧链裸露的氨基与5(6)羧基荧光素缩合反应，得到序列Boc-C(Trt)-K(FAM)-r(Pbf)-Cha-r(Pbf)-Cha-r(Pbf)，而后将多肽序列从树脂上裂解下来，纯化后得到纯净的H-C-K(FAM)-r-Cha-r-Cha-r-NH-NH2多肽，最后采用自然连接法将得到的多肽进行首尾环化，得到CMPP-1产物。本专利技术线粒体靶向透膜环肽，其多肽序列的首尾通过自然连接法实现成环，在环肽的赖氨酸侧链氨基上接入荧光团，从而实现细胞荧光可视化。本专利技术线粒体靶向透膜环肽的用途，是将其作为线粒体靶向肽载体，以将不同种类的生物活性物质靶向递送到线粒体。所述生物活性物质包括抗癌药物、抑制剂、带负电荷的染料等。抗癌药物包括阿霉素、苯丁酸氮芥、顺铂等。抑制剂包括甲氨蝶呤、克拉维酸、舒巴坦等。带负电荷的染料包括溴甲酚绿，和含有-COOH基团的染料。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提供的线粒体靶向透膜环肽能够专一性靶向细胞线粒体，共聚焦倒置荧光显微成像实验表明本专利技术结构对Hela细胞有良好的透膜性，与商业线粒体染料的共定位系数Pr＝0.74，此结构能够高效的靶向定位到线粒体。由于多肽穿透细胞膜的能力易受结构变化的影响，微小的结构改变，其穿透细胞膜的能力也会有巨大的差别。与已发表的H-Cha-r-Cha-r-Cha-r-NH2线性线粒体靶向肽相比，本专利技术提供的线粒体靶向透膜肽，能够稳定的定位线粒体，且提供了易于修饰的结构位点，在线粒体靶向透膜肽上修饰不同结构的氨基酸，仍然有较好的透膜能力。为靶向递送不同结构的活性物质，如小分子、多肽、蛋白质提供了一种具有潜力的递送工具。附图说明图1是CMPP-1、CMPP-2、CMPP-3在Hela细胞内的共聚焦成像结果，由图1可以看出，本发表所提供的线粒体靶向肽CMPP-1能够有效的定位到线粒体，且能够稳定的递送不同结构的氨基酸序列。图2是对线粒体靶向肽的筛选工作，从已报道的H-Cha-r-Cha-r-Cha-r-NH2靶向肽出发，通过改变多肽的序列、精氨酸的构象，以及对多肽进行首尾成环。筛选出能够有效定位到线粒体的多肽结构CMPP-1，从图2可以看出，多肽穿透细胞膜的能力易受结构变化的影响，微小的结构改变，其穿透细胞膜的能力也会有巨大的差别。具体实施方式实施例1：合成酰肼树脂将2-Cl-Trt-Cl树脂(200mg)用DMF(2ml)溶胀，在冰浴搅拌下，滴加DIEA(266ul)、水合肼(80ul)和DMF(800ul)混合液，冰浴搅拌20min后，体系在常温搅拌下反应70min后，加入40ul甲醇结束反应。将得到酰肼-Trt(2-Cl)树脂转移至沙芯漏斗中，依次用DMF、MeOH、乙醚充分洗涤3-5次，将树脂真空干燥器1h。实施例2：Fmoc法固相合成酰肼多肽合成序列为：Boc-C(Trt)-K(Alloc)-r(Pbf)-Cha-r(Pbf)-Cha-r(Pbf)-NH-NH21、将酰肼-Trt(2-Cl)树脂50mg(20umol)加入固相反应器中并用DMF溶胀15min。2、现配制O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种线粒体靶向透膜环肽，其特征在于：/n所述线粒体靶向透膜环肽简记为CMPP-1，其结构通式如下式I所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向透膜环肽，其特征在于：
所述线粒体靶向透膜环肽简记为CMPP-1，其结构通式如下式I所示：





2.一种权利要求1所述的线粒体靶向透膜环肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：合成酰肼树脂
将2-Cl-Trt-Cl树脂200mg加入DMF中溶胀，在冰浴、搅拌的条件下滴加266uLDIEA、80uL水合肼和DMF的混合溶液，冰浴下搅拌20min，然后将体系转移至常温下搅拌反应70min，加入40uL甲醇结束反应；将得到酰肼-Trt(2-Cl)树脂转移至沙芯漏斗中，依次用DMF、MeOH、乙醚充分洗涤，真空干燥；
步骤2：CMPP-1的合成方法
将步骤1获得的酰肼-Trt(2-Cl)树脂用Fmoc固相合成法合成序列为Boc-C(Trt)-K(Alloc)...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，杨倩倩，方葛敏，朱满洲，
申请(专利权)人：合肥修合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34