一种加压素的二硫类似物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种加压素的二硫类似物及其制备方法，通过对多肽药物加压素进行二硫键的替换得到一种还原条件下稳定的加压素二硫类似物，目标多肽的合成是通过Fmoc固相合成方法实现，粗品经纯化，冻干得到加压素的二硫类似物。还原稳定性实验表明本发明专利技术加压素的二硫类似物具有良好的还原稳定性。

A disulfide analogue of vasopressin and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种加压素的二硫类似物及其制备方法
本专利技术涉及一种加压素的二硫类似物及其制备方法，属于有机合成领域。
技术介绍
抗利尿激素，是一种由下丘脑分泌，储存在脑下垂体，然后释放到血液，帮助人体保持适宜水量的激素。抗利尿激素分泌不足会引起尿崩症，如果得不到及时的治疗，容易引起头痛头晕、记忆力衰退的症状，严重的患者会出现水中毒，出现视力下降、昏迷甚至是死亡，危害极大。加压素，又称抗利尿激素，目前作为一种二硫键环肽药物，半衰期在16到24分钟之间。二硫键在约束肽的构象上起着至关重要的作用，然而，二硫键在体内容易被硫醇和二硫异构酶还原，导致肽结构重排和生物活性的丧失。因此，寻找一种稳定的共价键替换易断裂的二硫键对于提高二硫键环肽的代谢稳定性和保持其生物活性具有重要的意义。
技术实现思路
针对加压素的二硫键在体内容易被硫醇和二硫异构酶还原的缺陷，本专利技术旨在提供一种还原条件下稳定的加压素二硫类似物及其制备方法。本专利技术利用Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH把加压素第6位半胱氨酸的S用CH2替代，形成一种还原环境下稳定的加压素二硫类似物。实验表明本专利技术加压素的二硫类似物在二硫苏糖醇DTT作为还原剂的条件下具有良好的稳定性。本专利技术加压素的二硫类似物，是通过使用二氨基二酸硫醚键替换普兰林肽二硫键后获得的。所述二氨基二酸为Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH，其结构式如下：本专利技术加压素的二硫类似物，其结构如下：本专利技术加压素的二硫类似物的具体制备过程包括如下步骤：步骤1：合成加压素二硫类似物线性树脂肽将RinkAmide-AM树脂转移到固相合成管中，DMF溶胀后采用Fmoc法依次进行氨基酸的缩合连接。步骤2：加压素线性树脂肽Alloc和Ally保护基的脱除配制Pd(PPh3)4和N-甲基苯胺的THF混合液(1倍当量Pd(PPh3)4:28倍当量的N-甲基苯胺：200uLTHF)，加入步骤1所得树脂中避光常温反应2小时；所得树脂依次用DMF、DMF配制的0.5％NaS2CN(C2H5)2溶液、DCM、DMF洗涤；步骤3：加压素二硫类似物线性树脂肽分子内环化外加20％哌啶的DMF溶液浸泡树脂，DMF洗涤树脂；配制PyAOP、HOAT和NMM的DMF混合液(5倍当量PyAOP：5倍当量HOAT：10倍当量NMM:150uLDMF)，加入步骤2所得树脂中反应4小时，反应结束后所得树脂用大量DMF洗涤；步骤4：加压素二硫类似物粗品的合成将步骤4中所得的树脂洗涤干燥后，加入切割试剂反应，随后收集切割液，加入冰乙醚沉淀，干燥得到加压素二硫类似物粗肽；步骤5：加压素二硫类似物粗品的纯化加压素二硫类似物粗肽溶解过滤后，滤液经反相C18柱进行分离纯化，收集所需要的流出液，样品峰合并后经冷冻干燥，获得加压素二硫类似物精肽。具体制备过程如下：步骤1：合成加压素二硫类似物线性树脂肽称量9.1mgRinkAmide-AM树脂(载量0.33mmol/g，3umol)于固相合成管中，DMF溶胀15分钟，加入20％哌啶的DMF溶液(2×10mins)脱除RinkAmide-AM树脂Fmoc保护基，用大量DMF洗涤。配制DIC、Oxyma和加压素二硫类似物线性肽C端第一个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma:100uLDMF:4.5倍当量加压素二硫类似物线性肽C端第一个氨基酸Fmoc-Gly-OH)，加入树脂中于55℃反应40分钟，用大量DMF洗涤树脂。封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89,V％)浸泡树脂2分钟，再次用大量DMF洗涤树脂。外加20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，用大量DMF洗涤树脂后，接下来氨基酸缩合重复上面的操作，依次缩合氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。对于特殊氨基酸Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH的缩合，加入2.6mgFmoc-A2-OH(4.5umol)、0.85mgOxyma(6umol)、3.1mgPyBOP(6umol)、2.1ulNMM(18umol)，100uLDMF，常温过夜反应。步骤2：加压素二硫类似物线性树脂肽Alloc和Ally保护基团的脱除称取3.6mgPd(PPh3)4(3.1umol),9ulN-甲基苯胺(83.2umol)溶解在200uL的THF中，加入到步骤1所得的加压素线性树脂肽中，常温避光反应2h；反应结束后，依次用DMF(3×1mL)、DMF配制的0.5％NaS2CN(C2H5)2(6×1mL)、DCM(2×1mL)、DMF(2×1mL)洗涤树脂。步骤3：加压素二硫类似物线性树脂肽分子内环化将20％哌啶的DMF溶液加入到步骤2所得的树脂肽中分别浸泡8分钟和6分钟，DMF洗涤；加入7.82mgPyAOP(15umol)、2.1mgHOAT(15umol)、3.4uLNMM(30umol)以及150uLDMF，常温反应4小时，DMF洗涤。步骤4：加压素二硫类似物粗品的合成将步骤3中所得的树脂肽依次用DMF、DCM洗涤后，自然干燥15分钟；加入200uL的切割试剂(88％TFA：5％苯酚：5％水：2％TIPS)，常温反应2h；收集切割液，树脂再用少量TFA洗涤1次，合并滤液后加入冰乙醚洗涤3次，自然干燥得到加压素二硫类似物粗肽H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-Pro-Arg-Gly-NH2(Cys1-Ala6,硫醚键)。步骤5：加压素二硫类似物粗品的纯化将步骤4得到的加压素二硫类似物粗肽溶于水中，过滤，滤液经反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA,B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA,体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm。以流动相B/％(5→5→32→80→90),Time/min(0→5→15→40→50)的梯度收集所需要的流出液，样品峰合并后经冷冻干燥，获得加压素二硫类似物精肽H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-Pro-Arg-Gly-NH2(Cys1-Ala6,硫醚键)，其HPLC谱如图3，其质谱如图4所示。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术的加压素二硫类似物与现有的加压素相比，还原稳定性HPLC跟踪实验发现提高了还原稳定性，并且在结构上只有一个原子的差别，避免了结构上的较大干扰。附图说明图1是加压素与本专利技术加压素二硫类似物的结构对比。图2是本专利技术的合成路线示意图。图3是加压素二硫类似物的HPLC谱图。图4是加压素二硫类似物的质谱图。图5是加压素还原稳定性测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种加压素的二硫类似物，其特征在于：/n所述加压素的二硫类似物是通过使用二氨基二酸硫醚键替换普兰林肽二硫键后获得的；/n所述二氨基二酸为Fmoc-A

【技术特征摘要】
1.一种加压素的二硫类似物，其特征在于：
所述加压素的二硫类似物是通过使用二氨基二酸硫醚键替换普兰林肽二硫键后获得的；
所述二氨基二酸为Fmoc-A2(Ally/Alloy)-OH，其结构式如下：





2.根据权利要求1所述的加压素的二硫类似物，其特征在于其结构如下：





3.一种权利要求1或2所述的加压素的二硫类似物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：合成加压素二硫类似物线性树脂肽
将RinkAmide-AM树脂转移到固相合成管中，DMF溶胀后采用Fmoc法依次进行氨基酸的缩合连接；
步骤2：加压素线性树脂肽Alloc和Ally保护基的脱除
配制Pd(PPh3)4和N-甲基苯胺的T...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，朱良静，方葛敏，朱满洲，
申请(专利权)人：合肥修合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34