一种缩宫素的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种缩宫素的生产方法，包括以下步骤：以AM Resin为载体，在缩合剂的作用下，与Fmoc‑链接剂在有机溶剂中反应，得到Fmoc‑Rink Amide AM Resin；采用Fmoc固相多肽逐步缩合法，根据缩宫素的肽序，利用Fmoc‑Rink Amide AM Resin在缩合剂的作用下，在有机溶剂中依次连接Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Asn‑OH、Fmoc‑Gln‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH和Boc‑Cys(Trt)‑OH，其间依次脱去Fmoc保护基团，得到缩宫素肽树脂；裂解、沉降、洗涤、干燥后得到线性缩宫素粗品；将线性缩宫素粗品的水溶液与I2/甲醇溶液进行环化反应，反应完全后纯化，得到所述缩宫素。

A production method of oxytocin

【技术实现步骤摘要】
一种缩宫素的生产方法
本专利技术涉及多肽合成
，尤其涉及一种缩宫素的生产方法。
技术介绍
缩宫素，英文名为Oxytocin，分子式为：C43H66N12O12S2，分子量为1007.2，化学结构式：Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(二硫键:Cys1-Cys6)。缩宫素为多肽类激素子宫收缩药物，可间接刺激子宫平滑肌收缩及刺激乳腺的平滑肌收缩，在生物医药领域具有广泛的应用。申请号为201710158573.0的中国专利公开了一种多肽液相合成缩宫素的方法，申请号为201510001735.0的中国专利公开了一种卡贝缩宫素的合成工艺。而目前国内缩宫素固相合成方法主要有以下缺陷：1，起始树脂AMResin或RINKAmide替代度偏低，很少超过1.0mmol/g，造成树脂、溶剂、裂解试剂浪费；2，氨基酸原料过量严重，一般都是2-4倍投料；3，单保护替代原料利用少，提高了生产成本；4，洗涤、脱保护次数过多；5，环化工艺繁琐。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种缩宫素的生产方法，本专利技术的方法采用最小保护策略，降低了原料成本，减少了合成步骤。本专利技术的一种缩宫素的生产方法，包括以下步骤：(1)以AMResin为载体，在缩合剂的作用下，与Fmoc-链接剂(Fmoc-Linker)在有机溶剂中反应，得到Fmoc-RinkAmideAMResin，其中，所述AMResin的替代度不低于2.0mmol/g；(2)采用Fmoc固相多肽逐步缩合法，根据缩宫素的肽序，从N端至C端，利用所述Fmoc-RinkAmideAMResin在缩合剂的作用下，在有机溶剂中依次连接进行氨基酸的活化偶联，所述氨基酸依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，其间依次脱去Fmoc保护基团，得到缩宫素肽树脂；(3)在裂解液的作用下，将所述缩宫素肽树脂进行裂解反应2-3h，反应温度为5-15℃，裂解完成后经沉降、洗涤、干燥后得到线性缩宫素粗品；(4)将所述线性缩宫素粗品的水溶液与I2/甲醇溶液进行环化反应，反应完全后纯化，得到所述缩宫素。进一步地，在步骤(1)中，AMResin为氨甲基树脂。Fmoc-链接剂指的是“4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸”，Cas号：145069-56-3，分子量：539.58。优选地，在步骤(1)中，起始树脂AMResin的替代度不低于2.0mmol/g，最高可到2.5mmol/g，减少了缩宫素生产过程中树脂、溶剂、裂解液等原料的用量。进一步地，在步骤(1)或(2)中，所述缩合剂为DIC和HOBt或HBTU、HOBt和DIEA。进一步地，在步骤(1)中，所述AMResin和Fmoc-链接剂的摩尔比为1:1.3-1.7。进一步地，在步骤(1)中，反应温度为30±5℃，反应时间为2.5-3h。进一步地，在步骤(2)中，氨基酸的活化偶联过程中，采用DBLK(20％哌啶/DMF)脱去Fmoc保护基团。进一步地，在步骤(2)中，所述缩合剂与Fmoc-RinkAmideAMResin的摩尔比为1：1.3-1.7，每一步氨基酸的活化偶联过程中，所使用的氨基酸与Fmoc-RinkAmideAMResin的摩尔比为1:1.3-1.7。进一步地，在步骤(2)中，活化偶联反应温度为30±5℃，反应时间为2.5-3h。优选地，在步骤(1)和(2)中，有机溶剂为DMF。进一步地，在步骤(2)中，还包括干燥缩宫素肽树脂的步骤。进一步地，在步骤(2)中，前9步偶联结束(即Boc-Cys(Trt)-OH偶联完成)后DMF洗涤2次，脱Fmoc保护1次，脱Fmoc保护结束后采用DMF洗涤4次，替代常规的偶联结束后DMF洗涤3次，脱Fmoc保护2次，脱Fmoc保护结束DMF洗涤5-6次，减少了溶剂使用量和洗涤次数。进一步地，在步骤(3)中，以体积分数计，所述裂解液包括85-95％三氟乙酸、3-7％苯甲硫醚、1-3％苯甲醚和1-5％的1,2-乙二硫醇。进一步地，在步骤(3)中，所述裂解液的加入量为5-10mL/g缩宫素肽树脂。进一步地，在步骤(3)中，采用甲基叔丁基醚或无水乙醚进行沉降。进一步地，在步骤(4)中，采用高效液相色谱法进行纯化，纯化时包括(S1)A相：1‰TFA水溶液；B相：乙腈；采用梯度洗脱，B相17-33％，洗脱30min，收集纯度大于98.5％样品；(S2)对步骤(S1)收集的纯度大于98.5％样品进行进一步纯化，纯化时使用的A相：50mmol/L的NH4Ac水溶液和0.4‰醋酸水溶液；B相：乙腈，其中梯度洗脱条件如下：第0-10min：A相：95％，B相5％，其中，A相为50mmol/L的NH4Ac水溶液；第10-20min，A相：95％，B相5％，其中，A相为0.4‰醋酸水溶液；第20-40min，A相：50％，B相50％，其中，A相为0.4‰醋酸水溶液；收集纯度大于99.5％的样品，即得到缩宫素纯品。如无特殊说明，本专利技术中，“替代度”指的是单位量的树脂所负载的物质的摩尔量，单位为“mmol/g”，其它各英文缩写所代表的含义如表1所示。表1本专利技术相关名词解释缩写含义Fmoc9-芴甲氧羰基Boc叔丁氧羰基Trt三苯甲基HOBt1-羟基苯并三唑tBu叔丁基DMFN,N-二甲基甲酰胺DICN,N'-二异丙基碳二亚胺TFA三氟乙酸DBLK20％六氢吡啶/80％DMF溶液HPLC高效液相色谱NH4Ac醋酸铵I2碘借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术在合成缩宫素的过程中，当偶联Asn、Gln和C端的Cys时，使用Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH和Boc-Cys(Trt)-OH替代常规合成方法中常用的Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH，降低了原料成本，简化了合成步骤。本专利技术的粗肽水溶液直接在I2/甲醇溶液作用下环化，可使用醋酸滴定至溶液澄清中止环化进程，工艺简单、方便快捷。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缩宫素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)以AM Resin为载体，在缩合剂的作用下，与Fmoc-链接剂在有机溶剂中反应，得到Fmoc-Rink Amide AM树脂，其中，所述AM Resin的替代度不低于2.0mmol/g；/n(2)采用Fmoc固相多肽逐步缩合法，根据缩宫素的肽序，从N端至C端，利用所述Fmoc-Rink Amide AM Resin在缩合剂的作用下，在有机溶剂中依次连接进行氨基酸的活化偶联，所述氨基酸依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，其间依次脱去Fmoc保护基团，得到缩宫素肽树脂；/n(3)在裂解液的作用下，将所述缩宫素肽树脂进行裂解反应，反应温度为5-15℃，裂解完成后经沉降、洗涤、干燥后得到线性缩宫素粗品；/n(4)将所述线性缩宫素粗品的水溶液与I2/甲醇溶液进行环化反应，反应完全后纯化，得到所述缩宫素。/n

【技术特征摘要】
1.一种缩宫素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以AMResin为载体，在缩合剂的作用下，与Fmoc-链接剂在有机溶剂中反应，得到Fmoc-RinkAmideAM树脂，其中，所述AMResin的替代度不低于2.0mmol/g；
(2)采用Fmoc固相多肽逐步缩合法，根据缩宫素的肽序，从N端至C端，利用所述Fmoc-RinkAmideAMResin在缩合剂的作用下，在有机溶剂中依次连接进行氨基酸的活化偶联，所述氨基酸依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，其间依次脱去Fmoc保护基团，得到缩宫素肽树脂；
(3)在裂解液的作用下，将所述缩宫素肽树脂进行裂解反应，反应温度为5-15℃，裂解完成后经沉降、洗涤、干燥后得到线性缩宫素粗品；
(4)将所述线性缩宫素粗品的水溶液与I2/甲醇溶液进行环化反应，反应完全后纯化，得到所述缩宫素。


2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：在步骤(1)或(2)中，所述缩合剂为DIC和HOBt或HBTU、HOBt和DIEA。


3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述AMResin和Fmoc-链接剂的摩尔比为1:1.3-1.7。


4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：在步骤(2)中，氨基酸的活化偶联过程中，采用DBLK脱去Fmoc保护基团。


5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：在步骤(2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄保胜，周黎，郑春旭，沈杰，陈维维，王良友，
申请(专利权)人：苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32