使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法技术

本发明专利技术涉及利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，所述方法包括利用固相化学分别合成1-12，13-20，21-28和29-37四个肽中间体片段，然后利用液相化学缩合得到普兰林肽。通过本发明专利技术路线制备普兰林肽，操作步骤简短，后处理简单，副产物少，产率高，污染小，适合大规模的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽药物合成
，具体涉及一种固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法。
技术介绍
普兰林肽(Pramlitide,结构见式1,2-7 ; 二硫键)是一种人工合成的胰淀素(Amylin，淀粉不溶素)类似物，其结构特征为胰淀素第25位(丙氨酸)、第28位(丝氨酸)和第29位(丝氨酸)的氨基酸分别用脯氨酸替代。它充分保留了内源性胰淀 素的生理作用，克服了人胰淀素在溶液中不稳定、易水解、易凝集的物理特性。临床研究表明，普兰林肽可抑制胰高糖素的释放，延缓胃排空及抑制摄食；与胰岛素联合应用，能有效地控制血糖、减轻体重、减少胰岛素用量。普兰林肽最早由美国Amylin Pharmaceuticals公司研制,于2005年3月16号获得美国FDA批准，适用于使用胰岛素但无法达到预期疗效的I型和II型糖尿病患者的辅助治疗。 1 I5 I101520 H-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Glo-Arg-Ley-AIa-Asn-Fhe-Ieu-Val-His-Ser-Ser- 25303Sρ, Asn-Asn Phe-G1y-Pro-lfe-Leu-Pro Pro*Thr-Asn V3l Gly*Ser Asii-Thr-Tyr-NH2 式⑴已知普兰林肽的合成可以通过固相合成法(W0-A-93/10146，US-A-5424394，CN102206266A, CN101747426A)，将C端酪氨酸的羧基以共价键的形式固定在不溶性树脂上，再以此氨基酸的氨基为起点，依次缩合氨基酸，延长肽链，在树脂上完成肽链的合成后，氧化第2位和第7位半胱氨酸的巯基形成分子内二硫键，再将该肽链从树脂上切割下来并脱除侧链保护基，最终制备得到普兰林肽。很显然，对于含有37个氨基酸的普兰林肽来说，这一合成途径需要重复几十步偶联和脱保护步骤，合成路线冗长，操作工艺繁琐；且随着肽链的延长和可能存在的二级结构的影响，缩合效率越来越差，导致杂质变多且难以分离，目标产物收率极低,成本很高,不适合工业化生产。使用固相和液相结合的片段缩合技术，适合于合成含有较长氨基酸序列的多肽，其优点在于副产物较少且易于纯化，产物纯度高。然而，片段缩合策略有时会受阻于(i)有增加消旋的危险；(ii)大的保护片段溶解度差；(iii)片段间的低缩合率并伴有副反应发生的危险。为了消除或减少消旋，一般选择Gly或Ρι·ο作为片段的C端残基，如果不能实现这一点，则选择Ala或Arg作为C端残基，因为它们不易消旋。在应用片段缩合策略时，对目标序列进行合理的分段可以大大改善结果。除了合理选择C端残基，尽量减少消旋的风险，还应考虑在固相上合成的片段的纯度要高，溶解性要好；参与缩合的片段的C端和N端残基的空间位阻要小，以提高片段间的缩合率。普兰林肽由37个氨基酸残基组成，因而存在许多种可能的片段和缩合顺序，例如CN101824086A 采用 1-8 (片段 1),9-19 (片段 2)，20_28 (片段 3)，29_37 (片段 4)四个片段，以(4+ (3+2))+1的顺序缩合的方法；CN102164608A (同族专利US2010/0081788A1)报道的方法与之类似，采用1-8 (片段1)，9-19 (片段2)，20-29 (片段3)，30_37 (片段4)四个片段，从C端到N端((4+3)+2)+1顺序依次缩合；CN101790535A(同族专利W02009/00366A1)报道了采用1-12 (片段1)，13-24 (片段2)，25-37 (片段3)三个片段从C端到N端顺序缩合的方法；CN102180943A则采用1-16 (片段1)，17_28 (片段2)，29_37 (片段3)三个片段从C端到N端依次缩合的方法。以上片段缩合合成策略中，前两种方法中第19位Ser (C端)和第20位Ser (N端)以及第四种方法中第16位Leu (C端)和第17位Val (N端)均不是理想的断点，因为在实际操作中这些片段间的缩合效率不高；第三种方法虽然断点选择较为合适，但片段3在固相合成上纯度不佳，将影响片段缩合反应效率。鉴于普兰林肽重要的药学应用价值，有必要提供更有效的普兰林肽合成方案，能 够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新的普兰林肽的制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。本专利技术中普兰林肽的制备方法，采用的是固相合成片段和片段液相缩合的组合技术。首先利用固相化学在树脂载体上合成普兰林肽的4个侧链保护的中间体片段肽片段a(1-12)，片段b (13-20)，片段c (21-28)，片段d (29-37)，然后在液相中将侧链保护的中间体片段肽缩合，最后脱除氨基端及侧链保护基得到普兰林肽。本方法中选择了适宜的4个片段肽，通过常规固相合成法均可以高效率、高产率、高纯度的获得各个片段肽；各个片段肽在液相缩合体系中溶解度高，且参与缩合的片段的C端和N端空间位阻小，缩合产率高，产物易于纯化。具体而言，本专利技术提供的普兰林肽制备方法，包括以下步骤(I) 利用固相化学方法，以氨基树脂为载体，合成侦U链保护的肽中间体片段a =AA29-AA37-氨基树脂，片段a的实例2937Fr ioc-Pro-Thr(P)-Asn{Tft)-Vaf-Gly-Ser{lBu)-Asn(Trl)-Thf(tBuI-Tyr(IBυ)- Μ· 脂;氨基树脂的实例为9-FmoC-氨基咕吨_3_氧基聚苯乙烯树脂或9-Fmoc-氨基咕吨-3-氧基乙酸甲基树脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethylResin)。(2)利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段b :AA21-AA28-二苯甲基树脂,片段b的实例21 28 (Fmoc- Asr (Tr{)-Asii{Trl)-Phe-Gly-Pro-|}e-Leu-Pro·:.木111 —. 树胎(3)利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段c :AA13-AA2(I-二苯甲基树脂,片段c的实例 1320Fnioc-Aia-Asn(Trt)-Phe-Leu-VaI-Hisdrt}-Ser(fBuI-Ser(P)-: -: $ Φ MWlM(4)利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体，然后形成2，7 二硫桥键，得到肽中间体片段d =AA1-AA12-三苯甲基树脂，片段d的实例 1 [...........................................................................................................................I12 .…K-LystBoc}-Cys-Asn(Trt|-T{ir(P}-Aia-Thr(P)-Cys-Aia-Thr(tBu}-Gin(TrtJ-Arg(Pbf)-Leu-￡ $ 中'M; iNf 脂片段a、c、d中P表示伪脯氨酸保护基(ΨΜε’ Me Pro)或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，普兰林肽结构式如式I所示，所述方法包括以下步骤：(1)？利用固相化学方法，以氨基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段a：AA29？AA37？氨基树脂；(2)？利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段b：AA21？AA28？三苯甲基树脂；(3)？利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段c：AA13？AA20？三苯甲基树脂；(4)？利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段d：AA1？AA12？三苯甲基树脂；(5)？将侧链保护的肽中间体片段a、b、c、d从树脂上裂解下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽（d？c？b？a）；(6)？脱除侧链保护肽（d？c？b？a）的氨基端保护基和侧链保护基，得到普兰林肽粗肽；(7)？纯化后得到普兰林肽。FDA0000169737411.jpg

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏贤斌，缪李鹏，毛怡春，王蔡典，董海军，
申请(专利权)人：南京工业大学，南京英沛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：