本发明专利技术属于生物化学和分子免疫学领域，涉及一种猪神经介素B多肽及其多克隆抗体制备方法和应用，本发明专利技术将猪神经介素B多肽的C端修饰多肽与载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白KLH耦联，获得NMB修饰多肽‑KLH耦联蛋白；乳化NMB修饰多肽‑KLH耦联蛋白并免疫新西兰大白兔；收集、分离得到含有兔抗猪NMB修饰多肽抗体的血清；采用Protein G纯化柱法对制备的NMB多克隆抗体进行纯化。该多肽抗原和多克隆抗体，具有制备方法简单、成本低、效价高的特点，并能够特异性结合猪组织中的NMB蛋白。
【技术实现步骤摘要】
一种猪神经介素B多肽及其多克隆抗体制备方法和应用
本专利技术属于生物化学和分子免疫学领域，涉及一种猪神经介素B多肽及其抗体制备方法和应用，所制备的抗体主要用于天然蛋白抗原的检测，具体是一种兔抗猪神经介素B多肽多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
神经介素B(NeuromedinB，NMB)是1983年从猪脊髓中分离纯化的一种神经肽，为哺乳动物蛙皮素(Bombesin，BN)样肽家族中的一员。在体内，NMB通过与细胞膜表面的受体(NMBR或BB1)结合发挥多种生物学作用，包括：刺激平滑肌收缩，调节胃肠道运动、摄食和体温，调控激素分泌，介导应激和恐惧反应，影响行为和记忆，促进细胞生长，调节生殖等。自NMB发现以来，国内外研究者对人、大鼠、小鼠等动物NMB及其受体在体内的表达和分布进行了大量的研究，发现NMB及其受体广泛表达于中枢神经系统和外周组织器官。猪是我国主要的经济家畜和人们动物蛋白的主要来源之一，也是一种重要的模型动物，保证猪的健康，提高猪的生产性能和繁殖能力，是畜牧兽医工作的重要责任，也为进一步研究人类疾病提供重要的参考价值。通过对猪NMB序列进行分析，我们发现猪NMB包括：24个氨基酸的信号肽、保守序列NMB-32和NMB-10(GNLWATGHFM)，这与人、大鼠和小鼠相同。另外，同源性比对结果表明猪NMB核苷酸和氨基酸序列与其他哺乳动物存在较高的同源性。通过荧光定量PCR我们发现NMBmRNA也广泛表达于猪的中枢神经系统和多种外周组织器官中，表明NMB可能作为神经递质或神经介质在猪中枢或外周组织器官中发挥作用。但是，由于市场上检测猪NMB蛋白抗体的缺乏，而且制备猪NMB单克隆抗体过程复杂、成本高、耗时长，使得NMB在猪体内的研究主要集中在基因水平，严重制约了NMB在猪上的功能研究。因此，制备用于猪NMB蛋白的抗体就显得特别重要，既能用于研究GRP在猪体内的生理功能，又能弥补市场上对此抗体的需求。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种猪神经介素B多肽及其多克隆抗体制备方法和应用，该多肽抗原和多克隆抗体，具有制备方法简单、成本低、效价高的特点，并能够特异性结合猪组织中的NMB蛋白。为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案得以实现：根据猪NMB蛋白全长氨基酸序列如序列列表SEQ-1，利用生物信息学相关软件选择一种猪NMB多肽抗原如序列列表SEQ-2。本专利技术提供一种猪神经介素B多肽，序列如序列列表SEQ-2所示。本专利技术提供一种猪神经介素B多肽，序列如序列列表SEQ-3所示。SEQ-1，分子类型及特征：NMB蛋白全长氨基酸序列，长度为121aa；序列为：MetThrLeuArgAlaArgGlyAlaArgLeuLeuGlyGlyLeuLeuPhePheThrLeuLeuAlaAlaGlyAlaAlaProLeuSerTrpAspLeuProGluProArgSerArgAlaGlyLysIleArgValHisProArgGlyAsnLeuTrpAlaThrGlyHisPheMETGlyLysLysSerLeuGluProProAsnProSerLeuLeuGlyThrThrHisHisIleSerLeuArgAspGlnArgLeuGlnLeuSerHisAspLeuLeuArgIleLeuLeuGlnLysLysAlaLeuGlyLeuSerLeuSerGlyProAlaSerHisThrProTyrArgArgLeuLeuValGlnThrLeuGluLysSEQ-2，分子类型及特征：NMB多肽抗原，长度为20aa序列为：AspLeuProGluProArgSerArgAlaGlyLysIleArgValHisProArgGlyAsnLeuSEQ-3，分子类型及特征：NMB修饰多肽，C端增加一个Cys，长度为21aa序列为：AspLeuProGluProArgSerArgAlaGlyLysIleArgValHisProArgGlyAsnLeuCys本专利技术还提供一种猪神经介素B多肽多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将上述猪神经介素B多肽的C端修饰多肽与载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白KLH耦联，获得NMB修饰多肽-KLH耦联蛋白；乳化NMB修饰多肽-KLH耦联蛋白并免疫新西兰大白兔；收集、分离得到含有兔抗猪NMB修饰多肽抗体的血清；采用ProteinG纯化柱法对制备的NMB多克隆抗体进行纯化。进一步的，通过耦联剂Sulfo-SMCC将猪神经介素B多肽的C端修饰多肽与载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白KLH耦联。进一步的，免疫的方法为：采用背部皮下多点注射的方法，将乳化后的抗原注射免疫新西兰大白兔；首次免疫，取1mg完全抗原溶于1mL的PBS液中，并和等体积的弗氏完全佐剂进行充分乳化；首次免疫2周后进行加强免疫；加强免疫的次数为3次；四免后采集抗血清，对兔子进行麻醉，采用腹主动脉放血法大量采血，收集血液于37℃倾斜静置1小时左右，然后转入到4℃冰箱中静置12小时左右，使其充分析出抗血清，离心分离抗血清，分装保存于-80℃环境中。进一步的，检测抗血清的效价的方法为：用包被液把NMB多肽抗原稀释成1-10ug/mL，将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100uL，把酶标板置于湿盒内，于4℃包被过夜，用时在37℃温箱中先孵育半个小时；弃去包被液，用洗涤液加入包被过的酶标板孔中，用纱布或者滤纸扣干，洗3次，每次3-5min；在酶标板上每孔加入250uL封闭液，将酶标板置于湿盒内，37℃孵育2h，洗板同上；空白对照加入抗体稀释液，阴性对照加入未免血清，实验组加入倍比稀释1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800、1:409600、1:819200、1:1638400、1:3276800的抗血清，然后，将酶标板置于湿盒内，37℃孵育1-2h，洗板同上；酶标板各孔加入稀释倍数为1:3000的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗100uL，将酶标板置于湿盒内，37℃孵育1-2h，洗板同上；酶标板的每个孔中直接加入100uLTMB-过氧化氢尿素底物溶液，室温或37℃温育5-30min；向每孔中加入100uL2M硫酸终止液终止反应；将酶标板置于酶标仪中，测定450nm波长处的吸光度；当与阴性对照血清的比值大于2.1时，计算抗体效价。进一步的，抗体纯化的方法为：用注射器吸取10mL的bindingbuffer，一滴一滴地注入柱子，防止空气进入柱子中，速度1mL/min；吸取0.5mL抗血清+1.5mLbindingbuffer，加入柱中；用10mL的bindingbuffer洗柱子；在收集蛋白的EP管中先加入200μL的1MTris-HCl；用3mL的elutionbuffer洗脱柱子；收集纯化的NMB抗体。进一步的，对纯化后的NMB多克隆抗体进行猪组织中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪神经介素B多肽，其特征在于，序列如序列列表SEQ-2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种猪神经介素B多肽，其特征在于，序列如序列列表SEQ-2所示。
2.一种猪神经介素B多肽，其特征在于，序列如序列列表SEQ-3所示。
3.一种猪神经介素B多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2所述的猪神经介素B多肽的C端修饰多肽与载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白KLH耦联，获得NMB修饰多肽-KLH耦联蛋白；
乳化NMB修饰多肽-KLH耦联蛋白并免疫新西兰大白兔；
收集、分离得到含有兔抗猪NMB修饰多肽抗体的血清；
采用ProteinG纯化柱法对制备的NMB多克隆抗体进行纯化。
4.根据权利要求3所述的猪神经介素B多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，通过耦联剂Sulfo-SMCC将猪神经介素B多肽的C端修饰多肽与载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白KLH耦联。
5.根据权利要求3所述的猪神经介素B多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，免疫的方法为：采用背部皮下多点注射的方法，将乳化后的抗原注射免疫新西兰大白兔；首次免疫，取1mg完全抗原溶于1mL的PBS液中，并和等体积的弗氏完全佐剂进行充分乳化；首次免疫2周后进行加强免疫；加强免疫的次数为3次；四免后采集抗血清，对兔子进行麻醉，采用腹主动脉放血法大量采血，收集血液于37℃倾斜静置1小时左右，然后转入到4℃冰箱中静置12小时左右，使其充分析出抗血清，离心分离抗血清，分装保存于-80℃环境中。
6.根据权利要求3所述的猪神经介素B多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于，检测抗血清的效价的方法为：用包被液把NMB多肽抗原稀释成1-10ug/mL，将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100uL，把酶标板置于湿盒内，于4℃包被过夜，用时在37℃温箱中先孵育半个小时；弃去包被液，用洗涤液加入包被过的酶标板孔中，用纱布或者滤纸扣干，洗3次，每次3-5min；在酶标板上每...
【专利技术属性】
技术研发人员：马志禹，许艳，刘德鹏，杨瑞琪，郭军培，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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