一种黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析技术领域。包被ＡＦＢ↓［１］－ＢＳＡ发光微粒加入微孔板，顺序加入ＡＦＢ↓［１］标准或样品、兔抗ＡＦＢ↓［１］抗体和生物素化羊抗兔抗体避光反应，避光加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。包被在发光微粒上ＡＦＢ↓［１］－ＢＳＡ与标准或样品中ＡＦＢ↓［１］竞争连接到ＡＦＢ↓［１］抗体，与生物素化羊抗兔抗体及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体，在光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，光信号强度与样品中ＡＦＢ↓［１］浓度成反比，对照标准曲线确定被测样品中ＡＦＢ↓［１］含量。本发明专利技术用于对粮食，饲料及其制品中ＡＦＢ↓［１］含量检测，提供的试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
一种黄曲霉毒素B,的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于 光激化学发光免疫分析(LICLIA)
，用于对词料，谷物及其制品中 AFBi含量的检测。
技术介绍
黄曲霉毒素B！ (AFB!)是真菌黄曲霉Hspergillus flavus和寄生曲霉 A.pamsilicus菌株产生的一组强毒性的次生代谢产物，尤其是AFB,为强污染 物质，分布范围广，能引起人类、各种饲料动物的急性中毒死亡，还能引起 致癌，致畸，致突变，即使几十吗/kg的含量仍有很大的毒性。食品和词料 中黄曲霉毒素lmg/kg以上有剧毒。其毒性为氯化钾的10倍，为砒霜的68 倍。食用被黄曲霉毒素污染严重的食品后可出现发热，腹痛，呕吐，食欲减 退，严重者在2 3周内出现肝脾肿大，肝区疼痛，皮肤黏膜黄染，腹水，下 肢浮肿及肝功能异常等中毒性肝病症状，也可能出现心脏扩大，肺水肿，甚 至痉挛，昏迷等症。由于不易防止食物被真菌污染，因此人们对长期食用低 剂量黄曲霉毒素污染的可能性非常关注。由于黄曲霉毒素特别是Bi是潜在的 致癌物质，人长期接触低剂量的黄曲霉毒素可能会有影响，1988年国际癌症 研究机构将AFB!列为1A类致癌物质。AFBi是最强的致癌物质，它在食物中的法定限量非常低，其限量标准 为2吗/kg。欧盟委员会对婴幼儿食品中的毒素限量标准进行了补充。草案规 定，在包括谷类食品在内的婴幼儿食品中，毒性最大的AFBi的最大限量为 0.05吗/kg。目前AFBi的测定方法有多种，如薄层色谱法TLC(灵敏度为5pg/kg)， 高效液相色谱法HPLC (灵敏度为0.02|ig/kg)，但由于费时，灵敏度低，仪 器设备昂贵，操作复杂且不适用于大批量样品的检测等缺点。酶联免疫测定 法(ELISA)，由于其特异性强，灵敏度高，操作简便，不需直接接触毒素，且 特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们重视和采用。光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一 代化学发光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其 主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、 高灵敏和操作简单的特点。LICLIA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。 水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表 面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每 个微粒的表面包被着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680 nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生 存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为 200 nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能 级的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒， 单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近 的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的 浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底 非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距 离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并 发出光信号。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测AFBi的试剂盒及其检测方法，采用光 激化学发光免疫分析法(LICLIA)检测AFBp用于对饲料、谷物及其制品 中AFBt含量的检测。本专利技术其技术方案 一种黄曲霉毒素B！的光激化学发光免疫分析试剂 盒，黄曲霉毒素Bi简称AFBp其由白色不透明微孔板(1)， AFB^示准(2)， 连接AFBrBSA人工抗原的发光微粒(3)，兔抗AFBi的抗体冻干品(4)， 生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)和包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。连接AFBrBSA人工抗原的发光微粒(3)的制备在离心管中加入lmg 发光微粒，加入12.5 质量浓度1%的Tween-20， 0.05 mg AFB广BSA人 工抗原，10pL硼氢化氰钠，用0.1M、 pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲 液将体积补充到200nL， 37"C避光振荡反应48小时；加入10pL 0.3 M、 pH 5.0 的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37"C避光孵育1小时后 离心，分离得到已连接AFBrBSA的发光微粒，稀释后备用。AFBJ示准(3)，从AFB,纯品中稀释得到，稀释液为甲醇水体积比3 :7， AFB!标准共6瓶，AFB!浓度分别为Ong/mL， 0.05ng/mL， 0.5ng/mL， lng/mL， 10ng/mL， 100ng/mL。用所述的试剂盒检测AFBt的方法，取包被有AFBrBSA人工抗原的发 光微粒加入到白色不透明微孔板；加入AFBi标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗AFB,抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记 免疫反应；接着暗处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信 号，以加入AFB!标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数 据从标准曲线计算样品中的AFB!含量。检测AFB,的具体操作为取20pL包被有AFBrBSA人工抗原的发光微 粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的AFB,标准或处理好的样品到各自 的微孔中；加20pL兔抗AFBi抗体；继续加入20|iL生物素化羊抗兔抗体， 37t:孵育15分钟；暗处加175)LiL包被有链霉亲和素的感光微粒，37。C暗处 孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中 的AFB,含量。样品处理，玉米、谷物样品处理将样品粉碎至20目，取5克样品放在 试管中，加入提取液12.5mL，提取液为甲醇水体积比7:3，加塞振荡3 分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取lmL滤液用lmL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。本专利技术的有益效果本专利技术测定的基础是标记免疫反应。该检测试剂盒 结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。 附图说明图1:检测AFB!的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、 AFBd示 准，3、连接AFBi人工抗原的发光微粒，4、 AFBi的抗体冻干品，5、生物 素化羊抗兔抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。图2: AFBrLICLIA反应示意图。图3: AFBrLICLIA标准曲线图。 具体实施方案实施例l:制备试剂盒和检测玉米样品发光微粒和包被有链霉亲和素的感光微粒均购于博阳生物科技(上海) 有限公司。包被有AFB!人工抗原的发光微粒制备在离心管中加入lmg发光微粒，加入12.5 (iL 1% Tween-20， 0.05 mgAFB厂BSA人工抗原，10pL硼氢化氰钠，用O.IM、 pH 6.0的2-(N-吗啉) 乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200pL， 37。C避光振荡反应48小时。加入 10pL0.3M、 pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点， 37"C避光孵育1小时后离心，分离得到已连本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的光激化学发光免疫分析试剂盒，黄曲霉毒素Ｂ↓［１］简称ＡＦＢ↓［１］，其特征是由白色不透明微孔板（１），ＡＦＢ↓［１］标准（２），连接ＡＦＢ↓［１］－ＢＳＡ人工抗原的发光微粒（３），兔抗ＡＦＢ↓［１］的抗体冻干品（４），生物素化羊抗兔抗体冻干品（５）和包被有链霉亲和素的感光微粒（６）组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄飚，金坚，张艺，高雷，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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