通用快捷的免疫检测法及试剂和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一套新的免疫检测方法，试剂盒、试剂及其应用。本发明专利技术的特征在于：通过组合下述试剂中的至少两个非特异非竞争剂，特异性指示剂，一级抗体和抗原便可提供一易捷的免疫检测方法；该易捷的免疫检测法至少可以将下述步骤中的两个步骤：封闭、一级抗体结合、二级抗体结合，合并成一步反应。本发明专利技术的显著特征是将常规免疫检测中的步骤：封闭，一级抗体结合，二级抗体结合三个单独步骤合并成一步反应，并在一次反应中在固相上形成可检测的复合体，抗原－一级抗体－特异性指示剂或配体－受体－特异性指示剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术关于快捷检测蛋白的方法，试剂和试剂盒，适用于免疫检测领域。
技术介绍
免疫检测或者免疫测定是一种检测特异蛋白(例如，抗原，抗体，受体蛋白，配体)的非常有力和灵敏的方法.两种非常典型的免疫检测法:酶联免疫吸收分析(ELISA)及免疫印迹 法检测(Western Blot)开发于1970年代。随后由于辣根过氧化氢酶(HRP)-共轭抗体和碱性 磷酸酶(AP)-共轭抗体的成功的开发，免疫检测法才被广泛地用于特异蛋白的定性和定量分 析。现行常规的免疫检测程序(例如免疫印迹法)包括7步l.封闭，2.洗涤，3.—级抗体结 合，4.洗涤，5. 二级抗体结合，6.再洗涤，7.发色(使用colorimetric 、 autoradiographic 或者chemiluminescent).全部过程是费时、费力，通常要花费约5至7小时才能完成，因 此开发一个相对简单快捷的免疫检测法是很有必要的。现在己有不少关于改进该方面技术的报导。但这些改进大致可分为下述几类l.使用预 包埋并且预封闭的固相(例如，0sther等，美国专利4， 885， 235; 0sther等，美国专利5， 093， 230; Urnovitz's美国专利5， 447， 837; Rails等，美国专利6， 015， 681 ); 2.使 用预标记的一级抗体(例如，Pegg等，美国专利5， 212， 065; Ralls等，美国专利6， 015， 681; Rails等，美国专利6， 599， 691; Stewart's, 美国专利6， 503， 702; Slack等，WO 03/052379; Cullum等，WO 2005/003376 ); 3.使用特别或者附加的设备(例如，Peg等， 美国专利5， 212， 065; Slack等，WO 03/052379; Tung等,美国专利6， 627， 459; Ralls 等，W0 97/05486 )。然而，使用预标记的一级抗体的方法会降低检测灵敏度并减少选择一级 抗体的灵活性，而且预标记一级抗体通常很昂贵且非常受来源限制，只有相当有限的预标记 一级抗体在市场上可以买到。上述报导的所谓改进的免疫检测方法的最大界限是他们不通用 的，仅仅适于检测一种或者一组特定蛋白(抗原或抗体)，有些方法仍然不可免除那些耗时的 步骤封闭， 一级抗体结合，二级抗体结合。本专利技术提供一种通用的快捷的免疫检测方法。该方法在免疫检测中至少合并以下步骤 封闭，抗原结合， 一级抗体(Primary Antibody)结合，二级抗体(酶-共轭的探查抗体， Secondary Antibody)结合，中的任何两个步骤为一个快捷步骤.该本专利技术的最显著特征是 将封闭， 一级抗体结合及二级抗体结合这三个步骤合并成一步快捷反应。因此根据本专利技术开 发的免疫检测的整个程序只要三个步骤1 )一步快捷反应，2 )洗漆，及3 )显色。整个过 程花费不到一个小时。
技术实现思路
本专利技术涉及一种通用快捷的免疫检测法及试剂和试剂盒。其优点是1快捷，只要仅 仅0.5-1小时(常规的免疫检测要5 7小时)。2容易，只要一个步骤反应而不是一个多 步骤程序。3适合，适于自动的分析和手动分析。4具有常规免疫检测方法相似的灵敏度。 5花费低，有效率，抗体和试剂，分析体制稳定并且可重复使用。6简单， 一步直接了断的 过程，不需要标记一级抗体，不需要额外仪器和专门技能，也没有错综复杂的操作的过程。 7通用，适于绝大多数一级抗体，且适用于不同的种免疫检测，例如基于抗体-抗原反应的常 规的免疫检领lJ(WestemBlot， ELISA禾口 immunohistochemistry)，以及其它与抗体-抗原反应原 理相似的分析(例如，基于受体蛋白-配体反应的检测方法)。本专利技术为WesternBlot， ELISA， IHC/ICC及其它免疫检测提供了一项生产快捷免疫检测试剂盒的技术，也为现有的免疫检测 试剂盒提供了改进的方法。本专利技术涉及一种非特异性竞争剂的使用方法。非特异性竞争剂是一种不被使用在一个免 疫检测系统中一级抗体或者二级抗体(或者受体蛋白或配体)所识别的非特异性蛋白或分子，使用该方法，免疫检测中的封闭歩骤可以被忽略也不需要使用预封闭的固相。本专利技术涉及的非特异性竞争剂的用法是一种与在免疫检测系统中使用含有高浓度非特异 性竞争剂的方法。本专利技术涉及一种特异性指示剂溶液，它是含有预标记的特异性蛋白或抗体的溶液，该特异 性蛋白或抗体能特异地识别一级抗体(或者受体蛋白)而不影响该一级抗体(或受体蛋白)对抗 原(或配体)的识别能力。本专利技术涉及的特异性指示剂溶液中特异蛋白或抗体的特征是能特异性识别一级抗体(或受 体蛋白)的抗原结合区(或配体结合区)以外的一个区域(不论是天然区域还是人造区域)。本专利技术涉及特异性指示剂溶液中的特异蛋白或抗体是能特异性识别一级抗体(或受体蛋白) 的人为融合的部分，这个特异性指示剂溶液中的特异蛋白或抗体能特异性识别免疫球蛋白Fc 部分(或Fc-融合蛋白的Fc部分；该特异蛋白或抗体是一类蛋白选自蛋白L,蛋白A，蛋白 G，蛋白A/G， Fc-受体蛋白。本专利技术涉及特异性指示剂溶液中有关特异蛋白或抗体的标记。该标记是一种直接或者间 接可被检测的蛋白或小分子，例如胶体金，过氧化氢酶，碱性磷酸(酯)酶，egalactosidase， Paminase， rhodamine， Biotine， avidin， luminase，萤光标记物，方夂射性同位素及其混合 物。本专利技术在特异性指示剂的溶液中添加了高浓度的盐。 本专利技术涉及在免疫检测中使用特异性指示剂溶液和Fc受体蛋白的方法。 本专利技术涉及一种组合，它含有至少如下组分中的两个a. 非特异性竞争剂(一类不被检测系统内一级抗体或者二级抗体(或受体蛋白，配体) 所识别的非特异性蛋白)。b. 特异性指示剂(能特异地识别一级抗体(或者受体蛋白)而不影响该一级抗体(或受 体蛋白)对抗原(或配体)的识别能力的一类预标记的特异性蛋白或抗体)。c. 一级抗体(1st Ab.)。d. —种抗原(Ag)。 还可以选择性地包括Cofactor或者蛋白酶抑制剂。本专利技术所涉及的非特异性竞争剂是一非特异性蛋白选自来自与二级抗体相同动物种的 IH常Igs (immunoglobins)或血清、清蛋白、酪朊、明胶、蛋清白蛋白、脱脂奶粉及其混合 物。工本专利技术涉及在非特异性竞争剂与抗体的组合中所使用的非特异性竞争剂的重量比率比抗 体高。本专利技术涉及的组合溶液中含有高浓度的盐。本专利技术涉及在含有非特异性竞争剂和特异性指示剂的组合中再加入一级抗体和更进一步 加入抗原。本专利技术涉及含有非特异性竞争剂和一级抗体的组合；含有特异性指示剂和一级抗体的组 合；非特异性竞争剂和抗原的组合。在免疫检测中使用的根据本专利技术所述的那些组合方法也作为本专利技术的一部分。本专利技术 也是关于一种通用的快捷免疫检测方法，该方法在免疫检测的一个反应中至少合并以下 步骤中的任何两个a. 封闭。b. 抗原结合。c. 一级抗体结合。d. 二级抗体结合。本专利技术涉及在免疫检测中合并封闭和一级抗体结合成为一步反应的通用快捷免疫检测方 法；在免疫检测中合并封闭和二级抗体结合成为一步反应的通用快捷免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个关于非特异性竞争剂在无预先封闭的免疫检测中的用法，其特征在于：该非特异性竞争剂是不被一级抗体和二级抗体或受体蛋白和配体所识别一类非特异蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹松，邹冉，
申请(专利权)人：邹松，邹冉，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]