环丙沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种环丙沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术所述试剂盒包被有环丙沙星抗原的酶标板，镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体、环丙沙星抗体等。本发明专利技术还公开了应用上述试剂盒检测环丙沙星残留的方法。本发明专利技术提供的检测环丙沙星的试剂盒采用间接竞争时间分辨免疫分析技术，灵敏度高、稳定性好，大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，降低了成本，非常适合大量样品的筛查，具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检测
，涉及一种化学品污染残留的检测试剂盒及其制备 方法，具体涉及一种检测环丙沙星残留的时间分辨免疫分析试剂盒及其制备方法。
技术介绍
食品安全是关系到广大人民的日常生活的一件大事。食品安全问题主要包括食品 中的物理危害、化学危害和微生物危害等几个因素，其中化学危害主要包括兽药残留、农药 残留、重金属、环境有害物等。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)残留联合立法委员会将兽药残留定 义为动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及兽药有关的杂质。 兽药残留已成为困扰全世界食品安全的难题，也是各国用以设置贸易壁垒的最主要的手段之一。环丙沙星(Enrofloxacin)为一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，其抗菌谱广、 抗菌活性强，在临床和兽医临床上得到广泛应用。然而环丙沙星在兽医临床应用时所产生 的耐药性、残留毒性对人体的不良反应已引起广泛关注，其残留通过食物链积累会对人类 健康造成危害并使细菌产生抗药性。欧盟、美国、日本、中国均对环丙沙星此类抗生素做了 限量或禁用。由于动物性食品中的兽药残留问题越来越受到国际社会的关注，世界各国均 加强了对国际贸易中动物性食品中兽药残留的检测。因此，为了保证动物性食品的安全，保 障消费者健康，促进国际贸易的顺利开展，建立动物性食品中环丙沙星的检测标准具有重 要的意义。其结构式如下现今，国内外已经建立了许多方法检测动物性食品中残留的环丙沙星，包括微生 物检测法、HPLC法、MS法和LC-MS、免疫分析等方法。其中微生物检测法的检测限常高于药 物的最大残留量，不够灵敏，且难以用于样品的定性。仪器方法准确、灵敏，但是由于价格昂 贵、时间长、技术要求高等原因从而限制其应用于大批量样品的筛选。目前常用的免疫分析 方法有酶联免疫免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨免疫分析(TRFIA) 方法，其中时间分辨免疫分析(TRFIA)具有灵敏度高、快速、特异性强、稳定性好、操作简 便、分析结果准确等优点，是目前最具有潜力的免疫分析方法之一。时间分辨免疫分析(TRFIA)和通常的普通的荧光分析原理基本相同，只是TRFIA 采用了一种特殊的标记物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应 体系发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨免疫分析(TRFIA)是以镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)、铽(Te)等 稀土离子为标记物，稀土离子需通过双功能螯合剂的桥联作用才能标记抗原或抗体，双功 能螯合剂的一端与Eu3+等连接，另一端同抗原或抗体分子上的氨基连接。常用的螯合剂有 N2--二乙烯三胺四醋酸(DTTA)、异硫氰酸-苯基-EDTA及环化二乙 烯三胺五醋酸酐(cDPTA)等，它们含有带氨基羧酸或带异硫氰酸基羧酸等活性基团，有很 强的螯合稀土元素的能力。时间分辨免疫分析(TRFIA)根据免疫分析方法模式的不同可以分为竞争法和夹 心法两种。(1)竞争法主要用于小分子抗原、半抗原及一些抗体的检测。包括直接竞争法或 间接竞争法，直接竞争法一般在微孔板预先包被第二抗体，先加入一定量的第一抗体和样 品，孵育洗涤后再加入Eu3+标记的小分子抗原竞争结合第一抗体。间接竞争法一般在微孔 板预先包被抗原，加入一定量的第一抗体和样品，孵育洗涤后再加入Eu3+标记的第二抗体 进行示踪。而在一些抗体的检测中，标记抗体和样品中的抗体通过竞争结合一定量的中和 抗原来进行分析的。最后，通过孵育洗涤加入增强溶液，所测得的荧光强度与样品的含量成 反比，标准曲线为竞争抑制曲线。(2)夹心法用于大分子生物活性物质的检测，该分析的微孔板包被一株抗体，稀 土离子标记另一株抗体，最后形成抗体_抗原_抗体_标记物复合物，所测得的荧光强度与 样品的含量成正比，标准曲线为饱和平衡曲线。近年来时间分辨免疫分析(TRFIA)以其特出的优点逐渐为人们所重视，目前，该 技术已不局限于临床诊断领域，而渗透到生物学研究的各个领域。它是目前最灵敏的超微 量分析技术之一，其灵敏度高达10_19m°VL，较放射性免疫分析(RIA)的10_16m°VL高出3个数 量级。但目前尚无采用时间分辨免疫分析法检测环丙沙星的相关技术报道，更没有一种 适合进行环丙沙星时间分辨免疫分析检测的试剂盒，以便于实现高灵敏度、操作简单的大 批量快速检测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种检测环丙沙星残留的时间分 辨免疫分析检测试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供所述检测环丙沙星残留的方法，高灵敏度、操作简单， 能大批量快速检测。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现提供一种检测环丙沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，包括包被了环丙沙 星抗原的酶标板、环丙沙星抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体(二抗)；所述镧系元 素包括Eu3+、Tb3+、Dy3+或Sm3+等稀土元素。所述环丙沙星抗原是将环丙沙星和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、钥 孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白，通过碳二亚胺法(EDC)、活泼酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法 (氯甲酸异丁酯)进行偶联得到包被抗原与免疫原。免疫原与包被原通过柱层析进行纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定。所述环丙沙星抗体包括单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体。所述单克隆抗体经动物免疫、细胞融合与克隆、细胞冻存和复苏及体内诱生法制 备得到；所述动物免疫是以环丙沙星与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c小鼠进行间隔 免疫，间接免疫分析检测并得到血液里含有环丙沙星特异性抗体的小鼠脾脏。所述细胞融 合与克隆是取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞 争时间分辨免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或显微克隆法对 阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述细胞冻存和复苏是取 处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。 复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。所 述单克隆抗体的制备与纯化是采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石 蜡油，7 14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7 10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸胺法或 亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，_20°C保存。所述环丙沙星兔多克隆抗体是采用新西兰大白兔作为免疫动物，以环丙沙星与载 体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采 血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。所述环丙沙星基因工程抗体是指小分子抗体，包括Fab(由完整的轻链和Fd构 成)，Fv (由Vh和\构成)，ScFv (单链抗体，Vh和\之间由一条连接肽连接而成)，单域抗 体(仅由Vh组成)等经基因工程技术改造后的抗体。制备方法为提取环丙沙星单克隆细胞或经环丙沙星免疫原免疫后的小鼠脾细胞 的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测环丙沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被了环丙沙星抗原的酶标板、环丙沙星抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体；所述镧系元素为Ｅｕ↑［３＋］、Ｔｂ↑［３＋］、Ｄｙ↑［３＋］或Ｓｍ↑［３＋］。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙远明，王弘，徐振林，雷红涛，沈玉栋，杨金易，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]