新的酶兔疫测定系统技术方案

本发明专利技术涉及一种新的免疫检测法，其中所涉及的试剂及其用途，以及该免疫检测法所涉及的药盒。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的免疫检测法，其中包括的试剂和其使用，以及用于免疫检测的药盒。更具体地说，本专利技术涉及一种用于结合和检测抗体的新试剂，以及掺入该试剂的药盒和方法。酶联免疫测定(EIA)系统广泛用于许多疾病的血清学诊断，特别是那些涉及病毒因子条件的血清学诊断方法。这些检测系统不仅结合了放射免疫测定(RIA)系统的许多固有优点，而且比RIA更为简便、安全、经济。EIA可能在迄今尚未在较大程度上利用的领域内进行高质量血清学检测。理想的检测方法应是快速、经济、简单的，其应用稳定试剂并能安全地在实验室外使用，然而目前还没有一种EIA方法能满足这些要求。EIA中已广泛使用了许多酶，包括棘根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。然而，许多近来的报导(Yolken等，J.Imm.Methods，73∶109-123，1984;Wagle等，IndianJ.Med.Res.，81∶275-280，1985)描述，可将β-内酰胺酶用作酶联免疫测定法(EIA)的另一代用标记物。该酶很容易得到，价格便宜，在常温下有高更新速率，使用安全底物而且全部没有哺乳动物组织，与昂贵、不易得到并有潜在致癌底物的其他酶系统相比，该酶更为优越。而且β-内酰胺酶的活性可以通过深兰色聚乙烯醇(PVA)/碘络合物的褪色速率而能用肉眼观测出来，这是因为β-内酰胺酶水解青霉素之最终产物青霉酸(Penicilloicacid)的碘化作用所致。酶和可与免疫球蛋白产生特异反应之分子的结合物已得到广泛地使用。先前的报导已描述了β-内酰胺酶与多克隆抗体、单克隆抗体及抗生物素蛋白的共价键合，并在EIA系统中使用这些酶-蛋白质结合物(Yolken等，J.Imm.Methods，73∶109-123，1984;Wagle等，IndianJ.Med.Res.81∶275-280，1985)。然而，酶和葡萄球菌蛋白A或链球菌蛋白G的结合物两者均可与多种免疫球蛋白的Fc区特异结合，为检测这些抗体提供了普遍适用的工具。另外，β-内酰胺酶/蛋白A或G结合物对所有四种人IgG亚类均具有显著的亲和性。当这两种蛋白质特异地结合到免疫球蛋白的Fc区时，它们并不能损害所说的免疫球蛋白与抗原结合的能力。再者，β-内酰胺酶能够与蛋白A或蛋白G结合，以产生在很大程度上保留其酶促活性和免疫学活性的结合物。Ambedkar等人(HindustanAntiboticsBulletin，29∶4-5，1987)和Citri(以色列专利申请80313号，申请日1986年10月15日)介绍了在酶联免疫检测系统中使用蛋白A和β-内酰胺酶的原理。本申请涉及一种新的EIA系统，其包括使用一种联接到适当酶上的免疫球蛋白结合的蛋白质，用以检测和/或定量分析针对样品中之一个或多个特定抗原的抗体。该EIA系统包括(a)一种固相载体，其中与含抗体样品接触之所说固相载体的表面是由特异性抗原包被的，(b)使含抗体样品与结合载体的抗原反应，从而使存在于样品中的抗特异抗原之抗体结合到所说已被结合的抗原上，并且洗掉过量未结合的抗体，(c)将结合的抗体与免疫检测结合物一起保温，其中所说的结合物包含与结合抗体结合的免疫球蛋白活性受体及一种活性标记物，然后用水溶液洗去过量未结合的结合物，(d)通过与适当的底物，如一种可导致适当试剂产生可见之颜色变化的底物一起保温来测定标记酶的酶促活性，其中结合酶是结合免疫球蛋白并指示抗体存在的标记酶。因此本专利技术提供了一种用于结合并检测抗体的免疫检测试剂，其包括免疫球蛋白的活性受体及一种活性酶标记物。另外，本专利技术的特异结合检测方法，其可通过“夹心”型免疫检测法用于检测和/或定量分析样品(为一种液态介质)中的半抗原或抗原，所说的检测法中，“俘获抗体”被固定于固相表面上，以俘获存在于样品中的半抗原或抗原。然后加入抗半抗原或抗原的“第一”抗体以形成“夹心”，可通过与酶标记的免疫球蛋白受体(如蛋白G/蛋白A)一起保温并测定酶活性(如上面步骤(c)和(d)所述)来显示该第二抗体的结合。该方法只要求酶标记的免疫球蛋白结合抗体不与俘获抗体结合。使用不与免疫球蛋白结合受体结合的俘获抗体即可满足这一要求(例如，在使用蛋白G的情况下使用IgM，而在使用蛋白A的情况下则可使用由鸡血清或卵黄中制得的IgY)。用于检测和/或定量测定液体介质样品中半抗原或抗原的另一种方法，是向所说样品内加入对待测半抗原或抗原特异的抗体，并保温该反应混合物，其中所说的反应混合物与同一待测半抗原或抗原已固定于其表面上的固相载体相接触。结合已固定于固相表面上之抗原或半抗原的抗体量成比例地减少。通过用水溶液冲洗从固相载体上分离所说样品之后，进行上述步骤(c)和(d)，所得酶促活性与样品中半抗原或抗原的浓度成反比。经与具有已知标准半抗原或抗原浓度的参照样品相比较，可以计算出样品中半抗原或抗原的浓度。本专利技术的另一个目的是提供一种呈药盒形式的配套EIA系统。药盒包括一个特别设计的注射器或毛细管系统，与结合免疫球蛋白的蛋白-酶结合物一起提供一种价格便宜、便于使用、不需专用仪器、包含最少步骤、可用肉眼读数、一次性使用、与样品或试剂接触机会最少、并能满足快速检测之全部要求的配套检测系统。可以结合到EIA酶上的免疫球蛋白结合蛋白质包括能与所说的酶结合的任何免疫反应剂。适用的免疫反应剂包括免疫球蛋白、抗生物素蛋白、生物素及其他免疫球蛋白结合蛋白，例如对免疫球蛋白有强亲和力的大消化球菌(Peptococcusmagnus)蛋白L(LarsBjorck等，J.Imm.Methods，140(4)∶1194，1988)。可用于本专利技术之优选的免疫球蛋白结合蛋白为蛋白A和蛋白G，最好是蛋白G。适用于EIA的酶是那些通过与显色试剂底物反应，以引起一种明显且清晰的可见颜色改变而提供由肉眼可见之终点检测的酶。在本专利技术的优选实施方案中，β-内酰胺酶是一种结合的酶，它催化青霉素水解为青霉酸，其存在是通过PVA/碘或淀粉/碘溶液的明显颜色改变而显示的。本文所描述的EIA系统可用于检测针对任何抗原的抗体，尤其是病毒或细菌性抗原。该系统也适用于检测真菌或寄生虫病、自家免疫病、蛇毒素、血清成分、类固醇、激素或见于生物体液中之足够用于常规EIA的其他物质。生物体液包括全血、血清、血浆、唾液和脑脊髓液。因而，包被在固相载体上的抗原可包括那些由乙型肝炎病毒、风疹病毒、EB病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)中制得的抗原。可以使用的固相载体包括任何适用的结合抗原的载体，特别是毛细管系统和注射器，其包括可按照本专利技术的方法进行检测、并适于提供肉眼可见之终点检测的一次性使用的系统。本专利技术之EIA系统的优点包括1.借助蛋白G-β-内酰胺酶结合物使PVA/碘的褪色反应，使之在敏感性上可与其他检测系统相比。2.结合物的制备方法简便且成本较低。3.β-内酰胺酶具有高更新速率，价格较低且没有哺乳动物组织。4.报导指出，该结合物可长期(如至少一年)保持稳定(IgG/β-内酰胺酶，Wagle等，1985;蛋白A/碱性磷酸酶，Paln等，1981)，从而表明蛋白G-和蛋白A-β-内酰胺酶结合物及其他结合物均具有长的贮存寿命。5.对另一种位点测定法的适用性来说，其检测系统是配套的、可快速检测并易于完本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测和／或定量分析样品中之一种或多种抗体的酶联免疫检测系统，其包括（ａ）一固相载体，其中将与含抗体样品接触的所说固相载体的表面是用人特异性抗原包被的，（ｂ）使含抗体的样品与载体结合的抗原反应，从而存在于样品中之对已结合的抗原 特异的抗体结合到所说结合的抗原上，并洗掉过量未结合的抗体，（ｃ）使结合的抗体与免疫检测结合物一起保温，其中所说的结合物包含一种与已结合之抗体结合的免疫球蛋白的活性受体及一种活性标记酶，并用水溶液洗掉过量未结合的结合物，（ｄ）经与适当 底物一起保温来检测标记酶的酶促活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯洛多瓦瑞亚，卡莱恩安斯帕克斯，皮特威箫法兰兹，约翰佐德斯，
申请(专利权)人：澳大利亚慈善机关修女财产托管人，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]