免疫结合物的制备和使用制造技术

突变重组抗体或抗体片断，在所述抗体或抗体片断的轻链约１８位上具有非天然Ａｓｎ糖基化位点。２．按权利要求１所述的抗体片断，其中所述抗体片断选自Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ和单链Ｆｖ。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利技术的领域本专利技术涉及诊断和治疗上有用的新颖的免疫结合物。本专利技术特别涉及包含一种抗体片断的免疫结合物，这种抗体片断通过抗体片断轻链可变区上的碳水化合物部分共价结合于诊断和治疗剂上。本专利技术还涉及包含一种抗体部分的免疫结合物，这种抗体部分是在轻链可变区含糖基化部位的完整抗体，这种糖基化部位是通过使编码轻链的核苷酸序列突变而引入抗体的。本专利技术还进一步涉及制备这种结合物的方法。本专利技术还涉及使用这种结合物的诊断和治疗方法。2.相关技术单克隆抗体可结合于各试剂以形成免疫结合物，用于诊断和治疗。这些试剂包括螯合剂，它们使免疫结合物与放射性同位素形成稳定的结合，及细胞毒剂，例如毒素和化学治疗药物。例如，全身给药通常对病人毒性太大的细胞毒剂可偶联于抗癌抗体，其偶联方式使其毒性效应仅仅针对载有靶抗原的肿瘤细胞。免疫结合物的诊断或治疗效能取决于几种因素。在这些因素中，诊断或治疗剂与抗体的摩尔比和免疫结合物的抗体结合活性是较重要的。研究者们发现，可直接与抗体连接的诊断或治疗剂的最大数量受抗体分子上可变位点的数目和抗体免疫反应性的丢失的限制。例如，Kulkarni等(CancerResearch 412700-2706，1981)报道了可结合到抗体上而不明显降低抗原结合活性的药物分子的数目有一个限度。Kulkarni等发现，甲氨喋呤所获得的最高结合为每分子抗体约十分子甲氨喋呤，尝试将药物-抗体分子比递增超过十则降低了免疫结合物的得率，并损害了抗体活性。Kanellos等(JNCI 75319-329，1985)报告了类似的结果。为了获得高的药物-免疫结合物置换水平，又不明显降低抗原结合活性，研究者们研究了水溶性聚合物分子作为药物间接结合中介物的应用。这样的聚合物包括氧化葡聚糖(Arnon et al.，Immunol.Rev.625-27(1982))、聚谷氨酸(Greenfield et al.，Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals2201-216(1989))、人血清白蛋白(Baldwin et al.，NCI Monographs 395-99(1987))和羧甲基葡聚糖(Schechter et al.，Cancer Immunol.Immunother.25225-230(1987))。Shih等(Int.J.Cancer 41832-839(1988))描述了位点特异性偶联方法，这种方法中，甲氨喋呤经氨基葡聚糖偶联到抗体恒定区或“Fc”区的碳水化合物部分上，产生置换比例高并保持免疫反应性的免疫结合物。晚近，Shih等(Int.J.Cancer 461101-1106，1990)证明了包含经氨基葡聚糖结合到单克隆抗体的Fc区碳水化合物部分上的5-氟脲嘧啶的免疫结合物的效能。在这两个研究中，Shih等都发现了免疫结合物包含每分子免疫球蛋白有约30-50个分子的药物。从而，诊断或治疗剂与抗体Fc区碳水化合物部分的间接结合提供了获得具有功能性抗原结合活性和高置换水平的免疫结合物的方法。用Fc区上的碳水化合物部分作为位点特异性结合位点的优点是所有亚型的抗体都典型地含糖基化的Fc区。一般地说，抗体分子在其Fc区在按其同型的特征位置上进行糖基化。例如，如Shih等所证实的，在IgG分子Fc区的CH2区域氨基酸297上典型地存在碳水化合物。在远离抗原结合位点的这个位置上，诊断或治疗剂与碳水化合物部分的结合对所得免疫结合物的免疫反应性产生的效应应为最小。但是，用Fc区的碳水化合物部分作为结合位点的缺点是免疫结合需要完整的抗体。抗体片断，特别是Fab、Fab′、F(ab′)2的使用比完整抗体的使用具有优点，因为片断能更好地从毛细血管扩散出来，进入靶组织。例如，见Brown，“Clinical Use of Monoclonal Antibodies，”in BIOTECHNOLOGY ANDPHARMACY，Pezzuto et al.，eds.Chapman & Hall，pp.227-249(1993)。此外，抗体片断确比完整抗体更容易从血液和正常组织清除。例如，完整鼠IgG血液半衰期为约30小时，而F(ab′)2和Fab/Fab′半衰期分别为约20小时和2小时(同上)。因此，使用抗体片断构建免疫结合物是有利的。在放射免疫治疗和放射免疫诊断的应用上，抗体片断特别有利，在这些情况下，正常组织暴露于放射性同位素必须是最小限度的。抗体可变区不经常含有能为从抗体片断制备免疫结合物提供潜在结合位点的碳水化合物部分。例如，在约15-25％鼠可变区鉴别出天冬酰胺偶联的碳水化合物受体序列。见Kabat et al.，SEQUENCES OF PROTEINS OF IM-MUNOLOGICAL INTEREST，5th ed.U.S.Department of Health and Hu-man Services(1990)。在抗葡聚糖族抗体的情况下，糖基化位点存在于重链可变区的互补决定区(CDRs)，特别是CDR2(同上)。这些抗体的CDRs上Asn偶联的碳水化合物的存在看来增强了抗原结合。见Wallick et al.，J.Exp.Med.1681099-1109(1988)；Wright et al.，EMBO J.102717-2723(1991)。然而，通过位点导向诱变在CDR2引入外加的碳水化合物结合位点，根据引入糖基位点的位置不同而导致对抗原亲和力的增强或减小(Wright等，同上)。因此，诊断或治疗剂与VH CDR区碳水化合物部分结合的可行性是不确定的。本专利技术者对碳水化合物结合的研究证明，Pawlak-Byczkowska等(CancerRes.494568-4577(1989))和Goldenberg等(J.Clin.Oncol.9548(1991))所描述的IgG抗体，鼠单克隆抗体LL2具有高结合效能。在还原条件下用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行的LL2结合物分析表明，在LL2抗体的轻链可变(VL)区存在糖基化位点。将LL2的VL区克隆化后，在VL区骨架1(FR1)序列的18-20位上发现Asn偶联的糖基化位点。这些研究提示，在VL区内的碳水化合物部分上可能有优先结合。这一意想不到的发现可解释为VL区易接近性改善。我们用位点导向诱变除去Asn偶联的糖基化位点，发现所得到的蛋白质显示与原来的抗体类似的免疫反应性。这一结果与专利技术者们的计算机模拟研究相一致，后者提示在轻链FR1碳水化合物部分和抗原结合位点之间可忽略的或最小限度的相互作用。这些研究表明，诊断或治疗剂与VL区FR1序列碳水化合物部分的结合提供了获得具有功能性抗原结合活性的抗体片断免疫结合物的方法。本专利技术提供制备包含诊断或治疗剂的新颖免疫结合物的方法，这些诊断或治疗剂经轻链可变区的碳水化合物部分结合于完整抗体或其抗原结合片断上。专利技术概述本专利技术涉及突变重组抗体或抗体片断，在所述抗体或抗体片断的轻链约18位上具有非天然Asn糖基化位点。本专利技术还涉及制备糖基化突变重组抗体或抗体片断的方法，包括以下步骤(a)培养表达和糖基化含一突变轻链和一重链的突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：HJ汉森，伦水恩，J谢文茨，GL格里菲思，SV戈文丹，
申请(专利权)人：免疫医学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：