一种用牛、马血清制备放免及生化质控物的方法技术

本发明专利技术为一种采用牛、马血清制备放射免疫和生化测定质控物的方法。本方法以牛血清或马血清为原料，用亲和层析法或离子交换层析法，特异性除去血清中所含的某种待测物或／和干扰测定的激素、生物活性物质、酶、电解质后，作为配制该待测物的生化或放免测定质控物的基质，在其中加入一定量的已知待测物，从而配制成为用放免或生化方法检测该待测物的质量控制品。本发明专利技术的优点是：原料来源丰富，成本低廉，使用安全。制备方法先进，产品质量稳定可靠。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制品(诊断试剂)的制备方法。所得产品可以作为放射免疫(RIA)和生物化学检测的质控物，是用于监控放免和生化测定准确性所必备的试剂。目前世界上普遍采用的质控物制备方法，是选择乙肝病毒表面抗原阴性(HBsAg(-))的正常人或病人血清，经简单处理后，进行调配制得。例如中华人民共和国卫生部药品和生物制品检定所(1981)曾用正常人混合血清加10%糖用活性碳搅拌6-8小时，4℃吸附24小时，4000rpm低温离心，取上清液经2kg/cm2氮气加压过滤除菌，得到低T3、T4纯品，分装，冻干，制成T3、T4放免质控物。上海市计划生育研究所(1983)制备生殖激素放免质控物，是收集含某种激素较高或较低的人血清，互相调配制成。近年出现在“剔除”某物质的血清中，加入被测标准物的方法。如英国爱丁堡实验室(1982)采用在人血清中加入少量标记LH和FSH，与过量偶联有豚抗LH和豚抗FSHIgG的琼脂凝胶处理，混合后，过夜。滤取血清，加入过量偶联有羊抗豚IgG琼脂凝胶处理，以去除血清中含有的少量豚抗LH和FSHIgG。此法仍不能完全除去LH和FSH，其血清中含标记的LH和FSH仍有原量的10%。生物化学检验质控物，近年有报导用动物血清取代人血清作原料者，但是均未采用亲和层析法和离子交换层析法处理血清。上述方法由于大多采用人血清作原料，大量采集不易，血清均质性差，乙型肝炎表面抗原阳性率高，大批量生产和长期保存困难，成本较高。而且，上述处理方法也不可能特异去除某种待测物或干扰物，因而得不到真正不含某种待测组分的“零”血清，故质控物的质量不高、稳定性差;且处理方法的工艺繁复，所用材料多只能一次性使用。本专利技术的目的是在提高质量，降低成本，保证使用安全的前题下，寻求一种质控物基质材料生产的新材料、新方法。本专利技术的要点是以马血清或牛血清为原料，过滤除菌后，经各种特定的亲和层析或离子交换层析处理，制成不含某种待测物或干扰物的“零”血清，再加入一定量的某种激素、生物活性物质、酶或电解质纯品，配制成包括零、低、中、高浓度该物质的放射免疫或生化质控物。本专利技术的优点是原料来源丰富，成本低，使用安全。制备方法先进，产品质量稳定可靠。实施例一、制取去激素和去生物活性物质血清的工艺流程如下(以去生长激素(hGH)血清的制备为例，参见工艺流程图1、2)。1、抗hGHIgG的提纯将抗hGH血清10ml用等体积Tris/Hcl(0.2M.PH8.6含2M/L Nacl)缓冲液稀释，加于SPA-琼脂糖凝胶(SPA-Sepharose 4B)层析柱(1×10cm)分离纯化。用0.1M的相同缓冲液淋洗至无蛋白流出后，用0.05MHAc/Hcl(PH3.0)缓冲液洗脱，收集洗脱液的蛋白峰，立即加入等体积的0.1MH3PO4(PH9.0)中和至PH8.6，此即为有活性的特异性IgG(回收率可达80%)。2、抗hGHIgG-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备①用已有技术Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(参见附录1)活化琼脂糖凝胶，在各自适宜的反应条件下与含抗IgG的反应液(5～10mgIgG/ml)按10～30mgIgG/lgm湿胶的比例偶联，制成亲和层析柱。收集偶联前、后液在280nm处作紫外分光测定，按下式计算偶联率和偶联容量IgG(gm)＝OD280nm÷1.3×V(ml)或直接在紫外光检测标准曲线上查得IgG的值(gm)。偶联容量＝〔偶联前IgG(gm)-偶联后IgG(gm)〕/湿胶(gm)偶联率＝ (〔偶联前IgG(gm)-偶联后(IgG(gm)〕)/(偶联前IgG(gm)) ×100%②用此胶装柱(1×10cm)，经0.1MTris/HAc(PH7.7)缓冲液淋洗平衡后，用加有微量示踪物的hGH马或牛血清溶液(1ug/ml)10ml(一般不大于柱床体积)过柱层析。同步监测其蛋白峰值、淋洗平衡液和洗脱液的放射性总计数，按下式计算亲和容量亲和容量＝ (洗脱峰总CPM)/((蛋白峰+淋洗液+洗脱峰+洗脱液)总CPM)×hGH总量＝可去除hGH量/一次层析一支偶联率为20%(1×10cm)柱，一次可处理血清200ml。3、去hGH血清的制备在正常牛、马血清中加入0.05% NaN3防腐，经蔡氏滤器过滤除菌后，一次加200ml血清上柱层析，收集层析前后的血清，用RIA法检测，确信层析后Bo/T%升高，hGH为零，NSB/T%基本不变后，方可置4℃贮存备用。层析柱用PH3.0的0.05MHAc/Hcl缓冲液洗脱吸留的hGH，然后以PH7.7的Tris/HAc缓冲液淋洗平衡，置8℃保存(可反复使用)。二、制取去酶血清工艺过程如下(参见Ⅰ艺流程图3)1、特异底物-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备①参照上述2①的条件和方法，将特异性酶的底物作为配体，偶联于活化好的琼脂糖凝胶上，同法测定其偶联容量和偶联率。②用此凝胶装柱，参照2②的方法测定、计算亲和容量和一次可处理的血清量。2、将牛、马血清参照上述3的方法处理后，过柱层析，取层析前后的血清标本用放免方法或生化方法检测其某种酶的含量，确信其为零后，方可置4℃贮存备用。三、制取去电解质血清的艺过程如下(参见附录2)1、去阴离子血清的制备用AE-.DEAE-.QAE-一类的阳离子交换剂装柱(已有技术Ⅳ)，将牛、马血清过柱层析，特异性吸留血清中的各种阴离子后，收集层析后的血清，即为去阴离子血清。层析柱用含阳离子的洗脱液洗脱后，经平衡再生，可反复利用。2、去阳离子血清的制备用CM-.phospho或SP-等一类阴离子交换剂装柱(已有技术Ⅴ)，参照上述1法层析，收集层析后的血清，即为去阳离子血清。此层析柱用含阴离子的洗脱液洗脱后，经平衡再生，可反复使用。四、各种放免及生化测定质控物的配制(以配制hGH放免质控物为例);用上述去hGH的牛或马血清为基质，稀释WHO第一国际参考标准的hGH冻干品，配成含hGH0.0，2.0，10.0和30.0ng/ml的质控物，分装成0.25ml/支，冻干，即可供出售或使用。本专利技术采用马、牛血清为原料，成本下降70～99%，血清均质性好，使用安全。本专利技术同时采用亲和层析或离子交换层析法处理血清，既特异地去除了其中所含的各种干扰物，又保留了血清中其它与测定无关的活性成份。因而用RIA法检测层析后的血清，各项质量参数明显提高(表1)，且优于用人血清制备的质控物(表2)，使用该基质配制的hGH-RIA质控性质稳定，回收率接近理想的回收率(表3)。表1.层析前后马血清的hGH-RIA测定值(N＝10)层析前 层析后NSB/T% Bo/T% hGH ng/ml NSB/T% Bo/T% hGH ng/ml3.35±0.43 35.68±1.23 0.0 3.82±0.65 37.26±1.22 0.0经配对资料T检验，层析前后NSB/T%无显著差异，而Bo/T%升高，有统计学意义(P＜0.05)。表2.层析前后单-正常人血清与混合马血清比较层析前 层析后NSB/T% Bo/T% hGH TSH Ins.NSB/T% Bo/T% hGH TSH Ins.(ng/ml)(μU/ml)(μU/ml) 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备放免疫和生物化学检测质控物的方法。其特征为：用马血清或牛血清，除去其中所含的干扰物和待测物，制成不含干扰物和原有待测物的各种基质血清。然后按需要再加入一定量的已知某种激素、生物活性物质、酶或电解质纯品、配制成包括零、低、中、高浓度的该物质（如激素、酶、电解质等）的放免和生物化学检测的质控物。

【技术特征摘要】
1.一种制备放免疫和生物化学检测质控物的方法。其特征为用马血清或牛血清，除去其中所含的干扰物和待测物，制成不含干扰物和原有待测物的各种基质血清。然后按需要再加入一定量的已知某种激素、生物活性物质、酶或电解质纯品、配制成包括零、低、中、高浓度的该物质(如激素、酶、电解质等)的放免和生物化学检测的质控物。2.根据权利要求1所述制备放射免疫和生物化学检测质控物的方法，制备各种基质血清。其特征是将特定抗体、底物或阴、阳离子交换剂，制成固定相，以牛或马血清作为流动相，过柱层析，特异性吸附其中所含的某种激素、生物活性物质、酶或阴、阳离子，制备成各种基质血清的方法。3.根据权利要求2所述制备各种基质血清的方法，制备去激素和去生物活...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓尚平，李幼平，赵桂芝，
申请(专利权)人：华西医科大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]