一种免疫磁性微球的制备方法技术

一种免疫磁性微球的制备方法，它涉及一种磁性微球的制备方法。它解决了制备免疫磁性微球现有技术的工艺复杂及对设备要求高，制得免疫磁性微球配基偶联量少、磁性粒子包覆不完全和磁响应性弱的问题。本发明专利技术方法主要步骤如下：１．化学共沉淀法制备磁流体；２．微乳液聚合法制备亲水性的磁性微球；３．对反应器进行封闭，然后将磁性微球和抗体放入反应器，温育后分离，用缓冲溶液洗涤；再用１％牛血清白蛋白溶液对磁球表面进行封闭，尔后温育，再分离、洗涤，得到免疫磁性微球。本发明专利技术方法制得的免疫磁性微球的磁化饱和强度高、免疫配基偶联率高，磁性粒子包覆完全，结合酶联免疫法可用于对环境污染物的检测；并且制备工艺简单、对设备要求较低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种磁性微球的制备方法。技术背景免疫磁性微球(又称免疫磁珠)是在磁性微球表面偶联抗体或凝集素， 使之能特异性地结合与之对应的抗原或生物素的一种新型功能材料。在生命 科学领域受到人们更广泛的关注和研究。由于免疫磁性微球粒径小，比表面积大，故而偶联容量大，便于高效地与目标产物偶联；又因其具有超顺磁性， 在没有外磁场的情况下能悬浮在溶液中，在外磁场的作用下固液相的分离十 分简单，甚至只用倾倒法就能完成，可省去离心、过滤等繁杂操作。免疫磁 球的制备分三个步骤 一是制备磁性纳米颗粒；二是在磁性纳米颗粒外面包 裹有活性功能基团的高分子材料制成磁性微球；三是在磁性微球表面偶联抗 体或凝集素制成免疫磁性微球。磁性微球偶联抗体有两种方法直接法和交 联法。直接法是指抗体直接联在磁性微球上；交联法是用双功能交联剂使磁 性微球与抗体共价结合在一起。免疫磁球结合酶联免疫法检测目标抗原有两 种方法直接法和间接法。直接法是指磁性微球连接抗体，直接与目标抗原 结合，从而指示抗原的浓度；间接法是指磁性微球连接二抗，检测的时候， 先用特异性抗体与抗原结合，再用连接二抗的磁性微球与抗原-抗体复合物结 合，从而间接地指示抗原的浓度。间接法与直接法相比，除适当范围广外， 还可以使用一组单克隆抗体，但要经过多次的洗涤步骤，特异性也会有所降 低。目前，制备免疫磁性微球的现有技术存在工艺复杂及对设备要求高，制 得免疫磁性微球配基偶联量少、磁性粒子包覆不完全和磁响应性弱的缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决制备免疫磁性微球的现有技术存在工艺复杂及 对设备要求高，制得免疫磁性微球配基偶联量少、磁性粒子包覆不完全和磁 响应性弱的缺点，而提供。本专利技术的免疫磁性微球的制备方法主要是由下述步骤实现的 一、化学共沉淀法制备磁流体a、在氮气保护下，按Fe2、 Fe3+: OH—的摩尔比为1: 2: 8 9的配比将氯化亚铁和氯化铁的混合溶液加入到重量百分比浓度为 20 25%的碱溶液中；再用盐酸调节至pH-6 7; b、向步骤一a步得到的反应 液中滴加占步骤一 a步反应液总重量3~5%的表面活性剂，迅速升温至 80°C~90°C，以300 600r/min速度保温搅拌1~2小时，冷却至室温，用磁铁 分离将固体分离出来后用质量百分比浓度为95%的乙醇溶液反复洗涤三至五 次，即得到磁流体；二、微乳液聚合法制备亲水性的磁性微球按重量份数 比将6 40份步骤一制得的磁流体、60~90份高分子聚合单体、3 6份交联剂 和1 10份引发剂超声分散至混合均匀，得到油相磁性胶体；然后在氮气保护 下，将油相磁性胶体加入水相，水相按重量份数比由0.5~1份乳化剂、0.4-0.8 份助乳化剂和98.2~99.1份分散介质的混合液；再在70。C 9(TC温度下，以 300~600r/min速度搅拌8 14小时，冷却至室温，用磁铁分离将固体分离出 来后用95%的乙醇溶液洗涤三至五次，再用蒸馏水洗涤三至五次，分散在水 中超声10min后保存，即得到亲水性的磁性微球；三、I 、对反应器进行封 闭先用质量百分比浓度为1%的牛血清白蛋白溶液充满反应器，在4。C条件 下存放10 15h，倒掉牛血清白蛋白溶液后再用缓冲溶液洗涤三至五次；II、 将磁性微球放入反应器，再按磁性微球与抗体质量比为100 400: 1配比加入 抗体，在30 37'C条件下温育2 6h或者在4'C条件下温育12 24h;用磁分离 架分离，然后用缓冲溶液洗涤分离出的固体三至五次，每次洗涤5分钟；III、 将洗涤后的固体用质量百分比浓度为1%的血清白蛋白溶液对磁球表面进行 封闭，尔后在30 37'C条件下温育l~6h，得到免疫磁性微球。本专利技术的免疫磁性微球的制备方法还可以在步骤三的II步中，在加入抗 体之前，向反应器中按磁性微球与碳二亚胺质量比为1: 10 20配比加入质量 百分比为20~25%的碳二亚胺溶液，然后在30 37。C条件下温育2 6h，经磁分 离架分离、用缓冲溶液洗涤分离出的固体三至五次。其它与上述方法相同。步骤一 a步中氯化亚铁和氯化铁的混合溶液中铁元素的浓度为0.9 1.8 mol/L。步骤一a步中碱溶液为NaOH溶液、NaHC03溶液或氨水溶液；在步 骤一b步中表面活性剂为油酸、硬脂酸或聚乙二醇；步骤二中高分子聚合单 体为苯乙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯或丙 烯酰胺；步骤二中交联剂为二乙烯苯或甲基丙烯酸乙二醇酯；步骤二中引发剂为过硫酸钠、过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈；步骤二中乳化剂为十二烷基 硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠。步骤二中助乳化剂为十六烷或十六醇；步骤二 中分散介质为体积百分比浓度为70~90 %的乙醇水溶液、甲醇水溶液或甲苯 水溶液；在步骤三II步中抗体是浓度为1 5pg/ml兔抗萘多克隆抗体；在步骤 三中缓冲溶液为pH=7.2 7.4的磷酸盐缓冲溶液。采用本专利技术方法可控制制得磁性微球粒径的大小；本专利技术制得的磁性微 球粒径在5~15pm之间。本专利技术方法制得的免疫磁性微球的磁化饱和强度高 (在磁场下，2min内能完全与水分离)、免疫配基偶联率高(2.0~2.5ng/mg)、 磁性微球具有良好的亲水性；本专利技术方法大大降低Fe304磁性粒子迁移至微 球外表面情况，使得磁性粒子较好的位于磁性微球里面，因而磁性粒子包覆 完全。本专利技术的方法制备工艺简单、重现性好，而且对设备要求较低。本发 明免疫磁性微球具有良好的的化学稳定性生物相容性，可用于直接从原料液 中分离富集有机污染物，结合酶联免疫法，可用于对环境污染物的检测。 附图说明图1是本专利技术Fes04颗粒的XRD图。图2为本专利技术的免疫磁性微球扫描 电镜照片。具体实施方式具体实施方式一本实施方式中免疫磁性微球的制备方法是由下述步骤 实现的a、在氮气保护下，按Fe2、 Fe3+: OH—的摩尔比为1: 2: 8~9的配 比将氯化亚铁和氯化铁的混合溶液加入到重量百分比浓度为20~25%的碱溶 液中；再用盐酸调节至pl^6 7; b、向步骤一a步得到的反应液中滴加占步 骤一 a步反应液总重量3~5%的表面活性剂，迅速升温至80。C 90。C，以 300 600r/min速度保温搅拌1 2小时，冷却至室温，用磁铁分离将固体分离 出来后用质量百分比浓度为95%的乙醇溶液反复洗涤三至五次，即得到磁流 体；二、微乳液聚合法制备亲水性的磁性微球按重量份数比将6 40份步骤 一制得的磁流体、60 90份高分子聚合单体、3 6份交联剂和1~10份引发剂 超声分散至混合均匀，得到油相磁性胶体；然后在氮气保护下，将油相磁性 胶体加入水相，水相按重量份数比由0.5~1份乳化剂、0.4 0.8份助乳化剂和 98,2~99.1份分散介质的混合液；再在7(TC 90。C温度下，以300~600r/min速 度搅拌8 M小时，冷却至室温，用磁铁分离将固体分离出来后用95%的乙醇溶液洗涤三至五次，再用蒸馏水洗涤三至五次，分散在水中超声10min后 保存，即得到亲水性的磁性微球；三、I 、对反应器进行封闭先用质量百 分比浓度为1%的牛血清白蛋白溶液充满反应器，在4-C条件下存放10 15h， 倒掉牛血清白蛋白溶液后再用缓冲溶液洗涤三至五次；II 、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫磁性微球的制备方法，其特征在于免疫磁性微球的制备方法主要是由下述步骤实现的：一、化学共沉淀法制备磁流体：ａ、在氮气保护下，按Ｆｅ↑［２＋］∶Ｆｅ↑［３＋］∶ＯＨ↑［－］的摩尔比为１∶２∶８～９的配比将氯化亚铁和氯化铁的混合溶液加入到重量百分比浓度为２０～２５％的碱溶液中；再用盐酸调节至ｐＨ＝６～７；ｂ、向步骤一ａ步得到的反应液中滴加占步骤一ａ步反应液总重量３～５％的表面活性剂，迅速升温至８０℃～９０℃，以３００～６００ｒ／ｍｉｎ速度保温搅拌１～２小时，冷却至室温，用磁铁分离将固体分离出来后用质量百分比浓度为９５％的乙醇溶液反复洗涤三至五次，即得到磁流体；二、微乳液聚合法制备亲水性的磁性微球：按重量份数比将６～４０份步骤一制得的磁流体、６０～９０份高分子聚合单体、３～６份交联剂和１～１０份引发剂超声分散至混合均匀，得到油相磁性胶体；然后在氮气保护下，将油相磁性胶体加入水相，水相按重量份数比由０．５～１份乳化剂、０．４～０．８份助乳化剂和９８．２～９９．１份分散介质的混合液；再在７０℃～９０℃温度下，以３００～６００ｒ／ｍｉｎ速度搅拌８～１４小时，冷却至室温，用磁铁分离将固体分离出来后用９５％的乙醇溶液洗涤三至五次，再用蒸馏水洗涤三至五次，分散在水中超声１０ｍｉｎ后保存，即得到亲水性的磁性微球；三、Ⅰ、对反应器进行封闭：先用质量百分比浓度为１％的牛血清白蛋白溶液充满反应器，在４℃条件下存放１０～１５ｈ，倒掉牛血清白蛋白溶液后再用缓冲溶液洗涤三至五次；Ⅱ、将磁性微球放入反应器，再按磁性微球与抗体质量比为１００～４００∶１配比加入抗体，在３０～３７℃条件下温育２～６ｈ或者在４℃条件下温育１２～２４ｈ；用磁分离架分离，然后用缓冲溶液洗涤分离出的固体三至五次，每次洗涤５分钟；Ⅲ、将洗涤后的固体用质量百分比浓度为１％的血清白蛋白溶液对磁球表面进行封闭，尔后在３０～３７℃条件下温育１～６ｈ，得到免疫磁性微球。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯玉杰，王健，田言，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]