用于有效反转录丙型肝炎病毒RNA的寡核苷酸引物及其使用方法技术

本发明专利技术描述了用于有效反转录丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的新型寡核苷酸引物。本文还提供了用于检测生物样品中ＨＣＶ核酸序列的方法和试剂盒。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于检测生物样品中核酸序列、特别是来源于感染性微生物的序列的改进方法。丙型肝炎病毒是一种世界范围内的经非肠道传染的病毒，它可导致大量输血后肝炎情况的发生和大量的偶发性(或群体感染性)肝炎情况发生。据估计超过1％的世界人口感染有HCV。HCV的感染与急性肝炎(通常是轻度的)、慢性肝炎(各种重度的)、肝硬变和随后发生的肝细胞癌有关。通常将HCV分在黄病毒科中的一种单独的属中(Hepacivirus)。它的基因组由约9,500个核苷酸的正链RNA分子组成，其中所述的核苷酸带有单一的较大可读框(ORF)，该可读框可编码约3,000个氨基酸的多蛋白前体。所述的较大ORF位于约340个核苷酸的5’非编码(NC)区域之前，它是基因组中最高度的保守区。ORF的5’区域(在5’-至-3’方向上)可编码一种衣壳蛋白、两种包膜糖蛋白(E1和E2)以及一种未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分可编码非结构性蛋白，它们包括蛋白酶、蛋白酶解旋酶的双功能蛋白、RNA聚合酶和调节肽类。来自全世界的对HCV编码序列的分析结果已经揭示出在各个病毒分离物中的相当可观的序列变化形式。此外，对来自各个患者的HCV序列分析结果已经证实这些病毒以所谓的“准种”的形式传播，它们含有相关但不相同的序列。人们认为存在于分离物中和各个患者体内的变化形式是由于病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶的低确限度所导致的结果。HCV遗传变异性的程度对预防、诊断和控制感染具有重要的意义。HCV感染的血清诊断一般通过市售可得的酶免疫测定物(EIA)来确定，所述的酶免疫测定物可检测结合重组HCV蛋白或肽的抗体。阳性EIA结果可由一种重组免疫印迹检测试验(RIBA)来证实，但是无论是EIA还是RIBA检测试验都不可能从现在的感染情况中区分过去。由于循环病毒的效价一般较低，所以还没有成功地开发出对病毒蛋白的直接检测法。此外，以抗体为主的检测法不能在通常接触后2-3个月内检测出HCV的感染。因此，本领域中存在一种对HCV的改进检测方法的需求，这些方法的敏感性足以在患者接最初触HCV后几天内检测出HCV病毒血症。因此，一方面，本专利技术涉及一种用于反转录生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。该方法包括下列步骤(a)在寡核苷酸引导与至少部分RNA互补的DNA的合成的条件下，使来源于所述样品的RNA与寡核苷酸接触；其中所述的寡核苷酸选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.6>、和(vii)上述任意寡核苷酸的任意组合物。在另一方面，本专利技术涉及一种用于检测生物样品中存在的丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。该方法包括下列步骤(a)用来源于所述样品的RNA作模板并用与所述RNA中含有的一段序列互补的寡核苷酸作引物来进行反转录反应，从而产生HCV特异性反转录产物，其中所述的引物选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ ID NO.6>、和(vii)上述任意引物的任意组合物；(b)扩增所述反转录反应的产物以便产生扩增产物；并(c)检测所述的扩增产物；其中对所述扩增产物的检测显示在所述的样品中HCV RNA的存在。扩增过程可以通过任意的方法来进行，优选聚合酶链反应(PCR)。根据本专利技术，HCV特异性反转录引物的应用可提供一种对检测样品、尤其是血浆中HCV的敏感性方法。在另一方面，本专利技术涉及一种用于检测生物样品中HCV的试剂盒。该试剂盒包括一种反转录引物，所述的反转录引物选自(i)5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNO.1>、(ii)5’-GTATCAGCACTC-3’(66RT12)<SEQ ID NO.2>、(iii)5’-AGTATCAGCACTC-3’(66RT13)<SEQ ID NO.3>、(iv)5’-CAGTATCAGCACTC-3’(66RT14)<SEQ ID NO.4>、(v)5’-CCAGTATCAGCACTC-3’(66RT15)<SEQ ID NO.5>、(vi)5’-GCCAGTATCAGCACTC-3’(66RT16)<SEQ IDNO.6>、和(vii)上述任意引物的任意组合物。所述的试剂盒可以另外包括用于反转录、扩增和产物检测的试剂和说明书。本专利技术者已经发现当具有与存在于HCV RNA中的某些序列互补的序列的寡核苷酸用作反转录反应的引物时，检测生物样品中的丙型肝炎病毒(HCV)RNA将会更为有效。特别是，所述引物的序列与HCV RNA接近的3’非编码区的序列一致。HCV的3’非编码(NC)区仅有98个核苷酸长，它过短以致于无法用随机引物引导该区域中的反转录过程。本专利技术提供了新型特异性寡核苷酸引物，这些引物可使来源于HCV基因组的3’非编码区的序列的反转录(并由此扩增和检测该序列)。将分子生物学、微生物学、重组DNA和蛋白质生物化学中的许多技术可用于实施本专利技术，诸如那些在例如《分子生物学的最新技术》(Current Protocols inMolecular Biology)1997第I、II和III卷(F.M.Ausubel编辑)；Sambrook等在《分子克隆实验指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)1989，第二版(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Sp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于反转录生物样品中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的方法，该方法包括下列步骤： （ａ）在寡核苷酸引导与至少部分所述ＲＮＡ互补的ＤＮＡ的合成的条件下，使来源于所述样品的ＲＮＡ与一种或多种寡核苷酸接触； 其中所述的寡核苷酸选自： （ｉ）５’－ＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣ－３’（５７Ｒ２７）〈ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１〉、 （ｉｉ）５’－ＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣ－３’（６６ＲＴ１２）〈ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２〉、 （ｉｉｉ）５’－ＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣ－３’（６６ＲＴ１３）〈ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３〉、 （ｉｖ）５’－ＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣ－３’（６６ＲＴ１４）〈ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４〉、 （ｖ）５’－ＣＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣ－３’（６６ＲＴ１５）〈ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５〉、 （ｖｉ）５’－ＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣ－３’（６６ＲＴ１６）〈ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６〉、和 （ｖｉｉ）上述任意寡核苷酸的任意组合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JM林南，KM戈曼，
申请(专利权)人：奥索临床诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]