制备针对环孢菌素及其代谢物特异性区域的抗体的方法技术

本发明专利技术涉及抗环孢菌素（ＣＳＡ）和／或环孢菌素代谢物／衍生物的特异性部位的多克隆和单克隆抗体的制备。这些多克隆和单克隆抗体的反应性使得它们特别适用于治疗药物监测（ＴＤＭ）的免疫检测。这些免疫检测或ＴＤＭ试剂盒可以包括针对环孢菌素和／或其代谢物的特异性部位的多克隆或单克隆抗体。这些试剂盒也可以包括多克隆抗体、多克隆和单克隆抗体或一组单克隆抗体的不同组合物。制备环孢菌素和环孢菌素代谢物的缀合物免疫原免疫宿主动物以产生直接针对环孢菌素或环孢菌素代谢物分子的特异性区域的抗体。通过测定特定抗体的特异性结合区域，开发了能够区分原分子、活性代谢物、无活性代谢物和其它结构类似的免疫抑制化合物的免疫检测方法。并描述了使用二乙烯砜做为连接臂分子形成环孢菌素和环孢菌素代谢物蛋白缀合免疫原。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备抗环孢菌素(Cyclosporine)和/或环孢菌素代谢物、衍生物和类似物的特异性部位的多克隆和单克隆抗体的方法。这些多克隆和单克隆抗体的反应性使得它们特别适用于治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)的免疫检测。这些免疫检测或TDM试剂盒可以包括针对环孢菌素(CSA)和/或其代谢物、衍生物及类似物的特异性部位的多克隆或单克隆抗体。这些试剂盒也可以包括多克隆抗体、多克隆和单克隆抗体或一组单克隆抗体的不同组合。
技术介绍
环孢菌素是一种真菌来源(从Tolypocladium Inflatum真菌分离)的11-氨基酸环肽，它含有两个稀有氨基酸(4R)-4-((E)-2丁烯基)-4,N-二-甲基-1-苏氨酸(Bmt)和I-α-氨基丁酸(Abu)，以及几个肽键N-甲基化的残基(残基1、3、4、6、9、10和11)。环孢菌素的结构如附图说明图1所示。目前，最常用于预防移植患者的器官排斥的两种免疫抑制药物是环孢菌素(CSA)和他克莫司(FK-506或FK)。雷帕霉素(Rapamycin，Rapa)是另一种已知的免疫抑制剂。环孢菌素的主要靶点似乎是辅助性T淋巴细胞。环孢菌素作用于T细胞激活过程的早期，它对正常时由T细胞产生的因子激活的其它细胞类型有继发效应。环孢菌素抑制辅助性T细胞产生白细胞介素2(IL-2)，由此阻断T细胞激活和增殖(免疫反应的放大)。它在预防和治疗急性进行性排斥均有效。目前的CSA作用机制模式提示，在T细胞的胞浆内，CSA与被称为亲免蛋白的特异性结合蛋白结合。该CSA-亲免蛋白复合物再结合并阻断被称为钙调神经磷酸酶的磷酸酶。后者是激活因子(NF-ATc)从胞浆到胞核转位所必需的，通常这种激活因子在胞核内结合并激活某些基因的增强子/启动子。在有CSA存在时，胞浆的激活因子不能到达细胞核，IL-2(和其它早期激活因子)的转录被强烈抑制。这种抑制的结果，T细胞不能增生，γ-干扰素的分泌被抑制，不能诱导MHCⅡ型抗原，也就不能进一步激活巨噬细胞。环孢菌素治疗有不同的副作用，包括中毒性肾损伤、高血压、高血钾症、低镁血症、高尿酸血症。已证明神经或肾中毒性损伤与某些环孢菌素代谢物相关。环孢菌素药物监测分析的必要条件是测定原环孢菌素药物和有免疫抑制及毒性活性的代谢物的水平。需要有改良的方法来监测CSA和/或CSA代谢物及衍生物的水平。专利技术概述本专利技术是描述制备能诱导产生抗环孢菌素相关化合物特异性抗体的免疫原性缀合物的方法。为了这种应用目的，术语环孢菌素相关化合物意指包括任何或所有的环孢菌素分子自身和/或不同的环孢菌素代谢物及衍生物。制备环孢菌素和环孢菌素代谢物缀合免疫原并用其免疫宿主动物，以产生直接针对环孢菌素或代谢物分子的特异性区域的抗体。通过测定特定抗体的特异性结合区域，开发了能够区分原分子(parent molecule)、活性代谢物、无活性代谢物和其它环孢菌素衍生物/类似物的免疫检测方法。描述了使用二乙烯砜(DVS)做为连接臂分子形成环孢菌素/代谢物-蛋白缀合物免疫原。首先，本专利技术提供能与环孢菌素相关化合物结合的抗体。优选这些能识别所述环孢菌素相关化合物或CSA代谢物AM1或AM9的特异性区域的抗体。单克隆抗体(mcAb)最佳。还提供了制备能识别环孢菌素相关化合物的特异性区域的抗体的方法，所述的方法包括a)给予动物包含环孢菌素相关化合物、连接臂分子和蛋白载体的免疫原，使其产生针对该环孢菌素相关化合物的特异性免疫原性反应；b)从所述动物收集针对所述环孢菌素相关化合物的抗体；和c)通过比较第一种和第二种环孢菌素相关化合物的抗体反应性鉴定抗体结合部位。这些方法中所述连接臂分子优选为二乙烯砜，并最好环孢菌素相关化合物于氨基酸残基1或9连接到载体上。所述蛋白载体可优选匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)或人血清白蛋白。也提供了使用杂交瘤细胞完成上述方法。另一方面，本专利技术提供测量哺乳动物体内环孢菌素相关化合物水平的免疫检测方法，包括a)将所述哺乳动物的生物标本与能与环孢菌素相关化合物结合的抗体一起孵育；和b)测定环孢菌素相关化合物与所述抗体的结合。在这些检测中优选使用识别所述环孢菌素相关化合物或CSA代谢物AM1和AM9的特异性区域的抗体。最优选使用单克隆抗体。也提供测定生物标本中环孢菌素相关化合物水平的免疫检测试剂盒，该试剂盒含有如上所述的一种抗体。还提供测定标本中特定的环孢菌素相关化合物的量的检测方法，包括a)将所述标本与根据权力要求1的第一抗体接触；b)将所述标本与根据权力要求1的第二抗体接触；和c)测定结合到所述第二抗体的所述特定环孢菌素相关化合物的量。附图简述图1描述环孢菌素A(CSA)的结构。图2描述CSA的主要代谢物及其代谢途径。图3显示单克隆抗体AM19-9-5A6对CSA代谢物AM1的选择性。图4显示单克隆抗体对AM9代谢物的选择性。图5显示单克隆抗体AM19-1-7E12对AM1和AM1c部分的选择性。图6显示单克隆抗体(MoAbs)对AM1和AM9代谢物的选择性的实施例。图7显示单克隆抗体AM9-9-4F5对CSA和AM9的选择性。图8显示单克隆抗体对AM1、AM1c、AM9和AM19代谢物的选择性较对原CSA分子的更大。图9显示MLR检测步骤。专利技术详述下列实施例描述实施本专利技术的最佳模式。这些实施例描述CSA代谢物的分离、半抗原的制备、免疫动物诱导抗体应答，抗体反应性鉴定、针对CSA及CSA代谢物或衍生物的多克隆及单克隆抗体的生产和选择及应用本专利技术提供的抗体的检测方法。下述实施例并不试图以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1-环孢菌素代谢物的分离和鉴定环孢菌素在肝脏、小肠和肾脏代谢。文献中用高压液相色谱(HPLC)和质谱法已经鉴定了Ⅰ期和Ⅱ期不同代谢物的结构。CSA主要代谢物如图2所示。代谢反应包括在氨基酸#1的氧化和环化以及在不同氨基酸部位的羟化和去甲基化。低速离10分钟。将内容物倒入分液漏斗；去除底层的水层，将上层的乙醚层蒸发至干。2．代谢物分离将1.0ml的HPLC级的甲醇加入已干燥的提取物中，涡旋30秒并以2800rpm离心2分钟。将上清液移入自动加样器小瓶，并用下述色谱分析条件注入尿液标本柱子 Spherisorb S5 C8 10×250mm保护柱 Spherisorb S5 C8 4.6×10mm波长 214nm过柱时间 90分钟柱温 60℃W600梯度表 根据以下典型保留时间收集各代谢物 以下是从20L尿液批次中回收的不同代谢物量的实例。 3．代谢物的定量分析重新将分离的代谢物溶入1ml MeOH中。取25μl该混合液并加入25μl CSG(20,000ng/ml)和300μl的流动相，涡旋并将100μl注入到下述条件的HPLC柱子 Spherisorb S5 C8 4.6×250mm温度 60℃流速 1.0ml/min波长 214nm流动相 33％H2O/47％ACN/20％MeOH4．代谢物浓度(代谢物峰面积÷内标峰面积)×0.5μg×(1/0.025)x稀释因子=代谢物量(μg)百分纯度(代谢物峰浓度μg/ml÷所有峰浓度μg/ml)×1005本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够与环孢菌素相关化合物结合的抗体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：RW雅特斯科夫，AJ马尔科姆，S奈克尔，
申请(专利权)人：伊索技术公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]